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    188宝金博页面版: Smad泛素化调节因子1在寻常性银屑病皮损区的表达

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    内容提示： 164 科杂志2006 箜 塑 鲞箜 』 丛 翌 Q ， ： Smad泛素化调节因子 1 在寻常性银屑病皮损区的表达 孙芸何威 张国威何云志黄海吴军 李顺碧 ： 转化生长因子 p(TG邛 )信号转导途径与银屑病的关系 已基本明确。除了发现血清 TG邛 水平变化与银屑病的关系 9bt'l2_． 在该病皮损区的表皮中还发现 I 型和 Ⅱ型 TG邛 受体 表达减少或缺失_3_， 提示 Tc 邛 信号转导途径障碍参与了寻 常性银屑病的发病过程 。Smad 泛素化调节 因子 1(Smad ubiquitination regulatory factor 1， Smuf f 1)能与 I 型 TG邛 受体 相互作用． 诱导该受体降解 。为此， 我们采用免疫组化和...

    文档格式：PDF | 页数：2 | 浏览次数：16 | 上传日期：2010-08-06 16:08:23 | 文档星级：
    164 科杂志2006 箜 塑 鲞箜 』 丛 翌 Q ， ： Smad泛素化调节因子 1 在寻常性银屑病皮损区的表达 孙芸何威 张国威何云志黄海吴军 李顺碧 ： 转化生长因子 p(TG邛 )信号转导途径与银屑病的关系 已基本明确。除了发现血清 TG邛 水平变化与银屑病的关系 9bt'l2_． 在该病皮损区的表皮中还发现 I 型和 Ⅱ型 TG邛 受体 表达减少或缺失_3_， 提示 Tc 邛 信号转导途径障碍参与了寻 常性银屑病的发病过程 。Smad 泛素化调节 因子 1(Smad ubiquitination regulatory factor 1， Smuf f 1)能与 I 型 TG邛 受体 相互作用． 诱导该受体降解 。为此， 我们采用免疫组化和逆 转录一 聚合酶链反应(RT—PCR )扩增技术对寻常性银屑病皮 损区Smuf f l 的表达情况进行了研究。 一、 对象 来 自我院皮肤科门诊和病房的寻常性银屑病患者 22 例， 其中男 12 例， 女 10 例 ， 平均年龄 39 岁， 平均病程 2 年 ； 以刀切法从腰背部或下肢的典型斑块型皮损处取材。所有患 者均有典型或较为典型的皮损， 并经皮肤病理检查证实具有 寻常性银屑病的病理改变； 近 3个月内未服用糖皮质激素及 免疫抑制剂，停止其他系统治疗和光疗法至少 1个月，近 3 周内皮损未行局部治疗。消退期的寻常性银屑病患者不纳入 本研究。正常人对照 10 例， 男 5例 ， 女 5 例， 平均年龄 25 岁， 其腰背及下肢部位的对照正常皮肤由我院整形外科及骨科 手术获得。每一标本取材后均立即分为两份， 一份置于 10％ 甲醛磷酸缓冲液中固定后， 按常规脱水、 透明并行石蜡包埋， 另一份立即放入液氮中冻存备用。 二 、 主要试剂 1． 试剂 ： 兔抗人 Smuf f l (H一 60) 多克隆抗体 ： sc一 25510 (Santa Cruz Biotechnology 公 司) ，过氧化 物酶标记 的链 霉亲 和素(sP)免疫组化试剂盒： HistostainTM - - Plus Kits(~t 京中山生 物技术有限公司) ，异硫氰酸胍和焦碳酸二乙酯 (Sigma 公 司) ， RT — PCR 试剂 盒 ： TaKaRa RNA PCR Kit Ver． 3． O(TaKaRa Biotechnology 公司 ) 。 2． PCR 引物及合成： 检索 NCBI GeneBank 数据库． 应用 Primer Premier 软件设 计人 Smuf f l 和 B一 肌动 蛋 白的 PCR 引 物， 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 人 Smuf f l 引物序列如下： 上游 ： 5 一 TCAGCCCTAGAGCC AACCAGTCAG一 3 ： 下游 ： 5 一TGCCCCCACCCCAAA CAAAAA c一 3 。内参照 B一 肌动蛋白引物序列如下： 上游： 5'- CTACAAT GAGCTGCGT GT GG一 3 ， 下游 ： 5 一 TAGCTCT FCTCCAGGGAGG A一 3 。 利用上述 引物经 PCR 扩增 555 bp 的人 Smurfl DNA 片 段和 460 bp 的人 B一 肌动蛋 白 DNA 片段 。 基金项 目： 第三军医大学科 研基金资助项 目(XG200356) 作 者单位 ： 400037 重庆 ， 第三军医大学 新桥 医院皮肤科 通讯作 者 ： 何威 ． em ail： xqderm a@m ail． xqhospita1． cor n ． ca ．短 篇 论 著 · 三 、 方法 1． 组织 RNA 的提。 取出液氮保存的银屑病皮损及正 常对照皮肤，按常规采用异硫氰酸胍一步法提取总 RNA ， 行 RNA 电泳检测其质量。 另用 DU800 型紫外分光光度计(美国 BeckMan 公司)检测 A 与 A 的 A 值 ， 根据 A26 0 ， A 比值判 定 RNA 纯度。 2． RT— PCR ： 利用上步提取的标本 RNA ， 按 RT— PCR 试 剂盒说明进行逆转录反应， 所得 cDNA 再经 PTC一 200 型 PCR 仪(美国 MJ Research 公司)分别扩增人 Smuf f l 和 p一 肌动蛋 白的 DNA 片段。PCR 反应体系50 预变性 3 min； 94 ℃ 30 s、 53 o C 30 s、 72 o C 50 s，共 30 个循 环： 72 C延伸 5 r a in。1． 8％琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增结 果 。 3．免疫组化： 4 m厚石蜡切片按常规脱蜡至水，按 sP 法 免疫组化染色常规检 测皮肤标本 中 Smurfl 表达。兔抗人 Sm uf f l 多克隆抗体(一抗)的工作浓度为 1： 50。实验设 PBS 替代一抗作为空白阴性对照。镜检结果判断： 细胞出现棕黄 色颗粒为染色阳性。按免疫组化染色结果判定常规进行半定 量分级： 无阳性着色细胞为(一 )， 阳性着色细胞比例 < 20％为 ( + ) ， 在 20％ ～50％为( ++) ， > 50％为( +++) 。 4． 图像分析： ①用德国Laica 公司 Qwin 真彩图像分析系 统对免疫组化染色结果进行分析， 以测定阳性表达区域的平 均灰度值表示 Sm uf f l 染色强度。②用 Chemi Im agerm 5500 型 凝胶成像分析仪(美国 Alpha Innoteeh 公司)测定 PCR 产物 电泳图中特异 DNA 片段的灰度值．计算出每一标本 Smuf f l／ B一 肌动蛋白灰度值的比值。 5． 统计学处理 ： 对免疫组化及 RT— PCR 结 果进行 图像 分 ， 循环参数如下 ： 94 0c 析， 所得的计量资料以均数 ± 标准差( ± s)表示。对银屑病 皮损与正常对照皮肤两组间均数的比较采用 SPSS V 12． 0 统 计软件进行 t 检验。 四、 结果 寻常性银屑病皮损组与正常人对照皮肤组 Smurfl 表达 的 RT— PCR 电泳结果见 图 1。经凝胶扫描分析系统分析处理 后所得出的Smurfl／ ~一 肌动蛋白灰度值的比值在寻常性银屑 病皮损组为 0． 641± 0． 162，在正常人对照皮肤组为 0． 021 ± 0． 016(t ：6． 59， P < 0． 01) ， 寻常性银 屑病皮损 组 Smurfl 的表 达水平显著上调。 sP 免疫组化染色显示 ，在寻常性银屑病皮损组 中． Smuf f l 在皮损区表皮中均有不同程度表达， 1 1例皮损标本呈 强阳性(+++)表达(图 2) ， 6 例为 中度阳性(++) ， 5 例为弱阳 性(+)。Smuf f l 主要表达于棘层和颗粒层角质形成细胞的胞 维普资讯 http://www.cqvip.com

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