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    188宝金博页面版: MiRNA_21与5_弗尿嘧啶对人结肠癌细胞HCT_116耐药性的关联分析

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    内容提示： MiRNA -21 与 5 -弗尿嘧啶对人结肠癌细胞HCT -116 耐药性的关联分析任 铁 军(洛阳市中心医院肿瘤三病区 ,河南 洛阳 　471000)[ 摘要] 目 的 : 探讨 miRNA - 21 与 5 - 弗尿嘧啶对人结肠癌细胞HC T - 116 耐药性的关联性 。 方法 : 采用 CCK -8 法检测 HCT -116 细胞 5 -FU 半数抑制量,在此浓度下 ,利用 Stem -loop 引 物反转录 miRNA -21 ,构建 T - miRNA -21 载体,采用 Real time PC R 绝对定量检测 miRNA - 21 在 5 - FU 作用下的表达 。 结果 : HCT -116 细胞对 5 -FU 的 IC50 值为(6. 56 ±0. 08)μg/μl ,定量结果显示 5 - FU 作用的细胞中 miR ...

    文档格式：PDF | 页数：3 | 浏览次数：21 | 上传日期：2014-09-25 12:49:04 | 文档星级：
    MiRNA -21 与 5 -弗尿嘧啶对人结肠癌细胞HCT -116 耐药性的关联分析任 铁 军(洛阳市中心医院肿瘤三病区 ,河南 洛阳 　471000)[ 摘要] 目 的 : 探讨 miRNA - 21 与 5 - 弗尿嘧啶对人结肠癌细胞HC T - 116 耐药性的关联性 。 方法 : 采用 CCK -8 法检测 HCT -116 细胞 5 -FU 半数抑制量,在此浓度下 ,利用 Stem -loop 引 物反转录 miRNA -21 ,构建 T - miRNA -21 载体,采用 Real time PC R 绝对定量检测 miRNA - 21 在 5 - FU 作用下的表达 。 结果 : HCT -116 细胞对 5 -FU 的 IC50 值为(6. 56 ±0. 08)μg/μl ,定量结果显示 5 - FU 作用的细胞中 miR -21 表达显著上调(P <0 . 01) 。 结论: miR- 21 在 5 - FU 的化疗过程中对出现的耐药性可能发挥着重要的作用 。[ 关键词] miRNA - 21 ; 5 -FU ; 结肠癌　　[ 中图分类号] R735. 35 　[ 文献标识码] A 　[ 论文编号] 1004-0951(2013)08 -0901-03　　结肠癌是指结肠黏膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变 ,辅助化疗是结肠癌综合治疗的一个重要组成部分[ 1]。 5 - FU 广泛应用于肠道恶性肿瘤的化学治疗 ,而一些结肠癌病例对 5 - FU 为主的化疗并不敏感 ,探究 5 - FU 的耐药性机理显 得尤为重要[ 2,-21 与 5 - 弗尿嘧啶对人结肠癌细胞 HCT -116 耐药性进行了关联分析 。GAATTTGCGT - 3' 。 hsa - miR - 21 实时 定 量PCR 下 游引 物为 通用 引 物 ,序 列为 5' - TGGT-G TCGTGGAGTCG - 3' ,上游 检测 引 物 5' - A-CAC TCCAGCTGGCTAGCTTATCAGAC TGATG- 3' 。 U6 上游引 物序 列为 5' - CTCGC TTCG-GCAGCACA - 3' 下游检测引物为反转录引 物。Real time PC R 结果分析 。 采用绝对定量进行检测 ,构建 miRNA - 21 及 U6 相关 T 载体 ,反转录的 miRNA 经 过 PCR 扩 增 ,将 PCR 产 物 按 照pEASY - Blunt Simple Cloning Kit 试剂盒说明书 ,进行室温 3 min 的连接 ,后热击转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,经过抗性筛选 ,选取阳性克隆子提取质粒 ,将质粒送往上海生工测序 ,鉴定结果 。 将阳性质粒测定浓度 ,采用 10 倍稀释法,制作标准曲线所需要的模板,10- 3、10- 4、10- 5。 经过上级检测 ,分析其拷贝数的变化 。 每次反应,每个样品至少重复 3 次 ,由荧光分析软件自动进行定量,最后取平均值 。3]。 本研究对 MiRNA1 　材料和方法1 . 1 　材　料人结肠癌细胞 HCT - 116 细胞株购自 上海研晶生物科技有限公司 。1 . 2 　方　法CCK - 8 法检测 5 - FU 半数抑制量 。 建立药物浓度处理模型 ,等 HC T - 116 细胞长满至 95 %时 ,采用 0. 25 %胰酶消化 ,经过细胞计数 ,调整细胞密度为 5 × 104,每孔 100 μl 接种于 96 孔板 ,过夜培养后 ,加入 5 -FU ,使其终浓度为 0. 125 ,0 . 25 ,0. 5 ,l,2 ,4,8 ,16 ,32 g/L ,共同培养至 12 h ,加入CCK - 8每孔 10 μl ,继续培养 4 h 后 ,在 450 nm 波长处检测 。 抑制率(fa) =[实验组平均 D (450) 值 - 空白组平均 D(450)值/细胞对照组平均 D(450) 值 - 空白组平均 D(450)值] × 100% ,根据抑制率采用直线回归方法计算药物的半数抑制浓度 IC50 值 。细胞模型与 细胞转染与 miRNA 的提取。 待HCT - 116 培养至细 胞密度 为 90% ,加 入 5 - FU6. 5 μg/μl ,培养 12 h 后根据 RNAiso for Small RNA提取试剂说明书提取总 microRNA 。stem - loop 引 物 反转录及 miRNA 表达检测 。根据 M IRBase 提供的 hsa- miR - 21 序列设计反转录引 物 。 引 物为 5' - CTCAAC TGG TGTCGTG-GAG TCGGCAA T TCAGTTGAG TCGGCATC -3' ,整个过程中选取 U6 作为内参基因 ,反转录采用自 己特异的下游引 物 ,序列为 5' -AACGCTTCAC-依次每个管中 的浓度变成 10- 1、 10- 2、2 　结 　果5 - FU IC50。 经过 CCK -8 作用后 450 nm 波901内蒙古医学杂志 Inner Mongolia Med J 2013 年第 45 卷第 8 期

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