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    188宝金博页面版: 1型人类免疫缺陷病毒体外复制、检测系统的建立及评价

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    内容提示： Modern Practical Medicine, December 2016, Vol.28, No.12· 1640 ·1 型人类免疫缺陷病毒体外复制、检测系统的建立及评价李杰，陈佩玉，郑毅，吴南屏【摘要】目的 建立 1 型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）体外复制和检测系统（JLTRG/H9 细胞混合培养体系），并初步应用于抗 HIV-1 有效药物筛选。方法 JLTRG 细胞与 H9 细胞按不同比例混合培养后，通过流式细胞技术分别于24、48、72、96h 观察和检测 JLTRG 细胞增强绿色荧光蛋白（EGFP）的表达来评估 JLTRG 细胞感染程度，并以此确定最优感染体系。然后以此最优体系来筛选抗 HIV-1 有效药物。结果 （1）在 JLTRG/H9 细胞混合培养体系...

    文档格式：PDF | 页数：5 | 浏览次数：423 | 上传日期：2017-02-06 18:02:09 | 文档星级：
    Modern Practical Medicine, December 2016, Vol.28, No.12· 1640 ·1 型人类免疫缺陷病毒体外复制、检测系统的建立及评价李杰，陈佩玉，郑毅，吴南屏【摘要】目的 建立 1 型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）体外复制和检测系统（JLTRG/H9 细胞混合培养体系），并初步应用于抗 HIV-1 有效药物筛选。方法 JLTRG 细胞与 H9 细胞按不同比例混合培养后，通过流式细胞技术分别于24、48、72、96h 观察和检测 JLTRG 细胞增强绿色荧光蛋白（EGFP）的表达来评估 JLTRG 细胞感染程度，并以此确定最优感染体系。然后以此最优体系来筛选抗 HIV-1 有效药物。结果 （1）在 JLTRG/H9 细胞混合培养体系中，JLTRG 与 H9 细胞混合培养比例为 10 ︰ 1 时，JLTRG 细胞 EGFP 表达量在各个时间点均为最高。（2）在 JLTRG/H9 细胞混合培养体系（JLTRG 与 H9 细胞数比值 10 ︰ 1）中，T-20 能有效抑制 JLTRG 细胞 EGFP 的表达，并且呈现剂量依赖性。结论 JLTRG/H9 细胞混合培养体系（JLTRG 与 H9 细胞数比值 10 ︰ 1）适用于 HIV-1 药物筛选。【关键词】 获得性免疫缺陷综合征；HIV-1；JLTRG 细胞；H9 细胞；药物筛选检测doi:10.3969/j.issn.1671-0800.2016.12.052【中图分类号】 R446 【文献标志码】 A 【文章编号】 1671-0800 ( 2016 ) 12-1640-03基金项目： 国家科技重大专项课题任务资助项目（2008ZX10001-006）作者单位： 325001浙江省温州，温州医科大学附属第二医院（李杰、郑毅）；台州医院（陈佩玉）；浙江大学医学院附属第一医院（吴南屏）通信作者： 吴南屏，Email: zhyygrxzz@163.com在艾滋病治疗方面尚无根治性的治疗方法。虽然高效抗逆转录病毒疗法（HAART）可减少艾滋病患者的机会性感染、延长生存期 [ 1 ] ；但病毒存在变异且可在细胞内潜伏感染，使其不能完全清除感染者体内的潜伏1 型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）病毒 [ 2 ] 。HIV-1 基因易变异及其免疫逃逸的特点致使耐药毒株的不断增多，此外当前主流 HIV-1 药物副作用亦较多，给治疗带来了严重的挑战，新的抗 HIV-1 药物开发迫在眉睫。笔者建立以JLTRG细胞基础HIV-1 体外复制、检测系统，报道如下。1 材料与方法1.1 试验材料、仪器 JLTRG细胞、H9细胞株购自 ATCC（HTB-176）。流式细胞仪：BeckmanCoulterPC500MPL，美国。1.2 实验方法1.2.1 HIV-1 体外复制、检测系统的建立 JLTRG 细胞和 H9 细胞混合培养，见表 1，分别于 24、48、72、96h吹打混匀细胞，取 180 l 细胞混合液于流式细胞仪专用试管，加 20 l40%甲醛混匀至终浓度 4%，室温静置 20min后，立即上机用流式细胞仪检测。1.2.2 HIV-1 体外复制、检测系统的评价 （1）JLTRG、H9 细胞的T-20 药物毒性试验。取收集好的细胞以 PBS 缓冲液洗涤 2 次，1 000 r/min，5 min 离心，弃上清，以无血清培养基重悬，轻轻吹打成单细胞悬液，调整细胞密度为1.0×10 4 /mlJLTRG 或 H9 细胞接种于 96 孔培养板中，设置 10 组，分别为空白对照组、T-20浓度分别为 7.8 nmol/L 组、1.56 nmol/L组、3.12 nmol/L 组、6.25 nmol/L 组、1.25nmol/L 组、2.5 nmol/L 组、5.00 nmol/L组、1.00 nmol/L组和 2.00 nmol/L组，每组设置 3 个复孔，每孔调整细胞体积为 180l，置于 37 ℃、体积分数 5%CO 2 饱和湿度培养箱中培养 4 h，取出培养板，每孔细胞中加入 20 l 胎牛血清放回 CO 2 培养箱中继续培养。作用 96 h 后，分别每孔加入MTT工作液 20 l，放回 CO 2 培养箱中作用4h，取出96孔板，以3000r/min，15 min 离心，小心弃去上清，每孔加入DMSO 200 l，震荡，使底部蓝紫色甲臜沉淀充分溶解。在酶标仪 570 nm 波长处读取吸光度值（A）。以空白对照组为100%。实验重复 3 次。（2）JLTRG 细胞和H9 细胞混合培养（JLTRG与H9 细胞浓度比 10 ︰ 1），设立 T-20 不同浓度梯度药物组和对照组，见表 2，分别于 24、48、72、96 h 流式细胞术检测。2 结果2.1 HIV-1 体外复制、检测系统的流式细胞检测结果 （1）JLTRG 细胞+H9 细胞上清孔：96 h 内 JLTRG 细胞 EGFP 表达量无明显改变。 （2）JLTRG 细胞孔（阴性对照孔）：JLTRG细胞的EGFP表达量低，并且96 h内无明显改变。 （3）JLTRG：H9 细胞比例为10︰1 时，24、48、72、96h的 值 6.05、30.52、90.72、204.10，高于JLTRG/H9 为 640 ︰ 1 的 值。（4）按细表 1 JLTRG/H9 细胞混合培养体系优化试验浓度/孔 1 2 3 4 5 6 7 8 9JLTRG 与 H9 10 20 40 80 160 320 640 0 0细胞数比值JLTRG（个/ml）5×10 5 5×10 5 5×10 5 5×10 5 5×10 5 5×10 5 5×10 5 5×10 5 5×10 5H9 （个/ml） 5×10 4 2.5×10 4 1.25×10 4 6.23×10 3 3.125×10 3 1.562×10 3 7.53×10 2— —H9 上清（1ml） — — — — — — —+ —注： “+”与“—”为“加”与“不加”；第 8 孔含H9 细胞病毒上清的JLTRG细胞悬液，第 9 孔为阴性对照组。

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