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    188宝金博页面版: 依维莫司对胃癌细胞株生长、迁移和侵袭的作用研究

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    内容提示： Modern Practical Medicine, April 2016, Vol.28, No.4· 478 ·依维莫司对胃癌细胞株生长、迁移和侵袭的作用研究俞榕，沈迎春【摘要】目的 探讨依维莫司对胃癌细胞 HGC-27 和 KATO III 生长、迁移和侵袭的作用。方法 采用 MTT 试验检测两种胃癌细胞在不同浓度依维莫司作用下的生长状况，并计算出相应的 IC50 值；采用流式细胞仪技术检测依维莫司作用后细胞周期状况；采用 Annexin V/PI 双染法检测依维莫司作用后细胞凋亡状况；采用 Transwell 法检测依维莫司作用后细胞的迁移和侵袭能力变化；采用 Western blot 法检测两种细胞的 mTOR 蛋白表达水平。结果 依维莫...

    文档格式：PDF | 页数：4 | 浏览次数：24 | 上传日期：2016-06-24 12:36:03 | 文档星级：
    Modern Practical Medicine, April 2016, Vol.28, No.4· 478 ·依维莫司对胃癌细胞株生长、迁移和侵袭的作用研究俞榕，沈迎春【摘要】目的 探讨依维莫司对胃癌细胞 HGC-27 和 KATO III 生长、迁移和侵袭的作用。方法 采用 MTT 试验检测两种胃癌细胞在不同浓度依维莫司作用下的生长状况，并计算出相应的 IC50 值；采用流式细胞仪技术检测依维莫司作用后细胞周期状况；采用 Annexin V/PI 双染法检测依维莫司作用后细胞凋亡状况；采用 Transwell 法检测依维莫司作用后细胞的迁移和侵袭能力变化；采用 Western blot 法检测两种细胞的 mTOR 蛋白表达水平。结果 依维莫司显著抑制 HGC-27 细胞和 KATO III 细胞的生长，并且这种抑制作用具有浓度依赖性；依维莫司诱导 HGC-27 细胞和 KATO III 细胞发生 G1 期阻滞；依维莫司诱导 KATO III 细胞发生凋亡，但不诱导 HGC-27 细胞发生凋亡；依维莫司抑制 HGC-27 细胞和 KATO III 细胞的迁移和侵袭能力；mTOR 蛋白在 HGC-27 和 KATOIII 细胞中均有表达。结论 依维莫司可以显著抑制胃癌细胞的生长、迁移和侵袭，可以作为临床上治疗胃癌，预防胃癌复发的靶向药物。【关键词】 胃肿瘤；癌；依维莫司doi:10.3969/j.issn.1671-0800.2016.04.033【中图分类号】 R735.2 【文献标志码】 A 【文章编号】 1671-0800 ( 2016 ) 04-0478-03作者单位： 330200宁波，鄞州区集市港镇卫生服务中心（俞榕）；宁波市医疗中心李惠利医院（沈迎春）通信作者： 俞榕 Email：huangjie1981_1981@163.com目前我国每年约 40 余万成为胃癌新患者，而约 30 余万胃癌患者死亡 [ 1 ] 。虽然外科手术已成为胃癌最主要的治疗手段，但部分患者仍需行化疗以延长生存期，降低复发率。目前靶向治疗药物在肿瘤治疗中吸引着众人的眼球。本研究检测目前临床上常见的靶向药物mTOR 抑制剂依维莫司对胃癌细胞株HGC-27 [ 2 ] 和 KATO III 细胞 [ 3 ] 生长、迁移和侵袭的作用。现将结果报道如下。1 资料与方法1.1 材料 人胃癌细胞株 HGC-27 和KATOIII均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；依维莫司购自瑞士novartis公司；RPMI1640 培养基购自美国 Gibco 公司；胎牛血清购自美国 Hy-clone公司；青链霉素购自美国Sigma公司；MTT试剂购自美国Sigma公司；An-nexin V-FITC 双染色试剂盒购自美国Invitrogen 公司；Transwell 细胞培养小室购自美国 corning 公司；抗 mTOR 单克隆抗体购自美国santa cruz生物公司；蛋白提取试剂盒购自美国 BD 公司；羊抗鼠二抗购买自美国KPL公司；ECL化学发光试剂盒购买自美国 Pierce 公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养 将人胃癌细胞株HGC-27 和KATOIII培养在 10 cm培养皿中，细胞均采用 RPMI 1640 培养基进行培养，RPMI 1640 培养基中需添加10%胎牛血清和 1%青链霉素。细胞培养在 37 ℃，含 5%CO 2 、95%空气的恒温培育箱中。细胞培养基每天更换，当细胞生长至70%～80%汇合程度时即予以0.25%的胰蛋白酶消化，然后以 1∶3 的比例接种至 3 个新的培养皿中。1.2.2 MTT 试验 将处于对数生长期的两种胃癌细胞接种消化接种至 96 孔板，保持每孔细胞数目约 5×10 3 个。在细胞培育过夜后，分别加入不同浓度的依维莫司（0、1、2、4、8、16、32 mol/L）。在药物处理 72 h 后，去除含有药物的培养基，PBS冲洗细胞，加入MTT溶液；在细胞与 MTT 溶液共同孵育 4 h 后，去除MTT 溶液，加入 DMSO 溶液。然后振荡混匀，在 37 ℃孵育 10 min。上酶标仪检测 490 nm 处的吸光值。根据 MTT 结果测算出IC50 值，在后续实验中依维莫司采用 IC50 值的浓度进行。1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 采用流式细胞仪检测细胞周期，选取对数生长期的 HGC-27 和 KATO III 细胞接种于 6 孔板培育过夜。分别加入 0、10、20、30、40 mmol/ml 依维莫司，在药物作用72 h后收集细胞，预冷的70%乙醇在4℃下固定细胞过夜，然后分别加入PI （终浓度50 g/ml）和冰冷RNA 酶（终浓度 50 g/ml）染色0.5 h，样本上流式细胞仪进行检测，采用 Flowjo 软件对流式细胞仪数据进行分析。1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 采用Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡情况，所有操作按照说明书进行。选取对数生长期的 HGC-27 和 KATO III 细胞接种于 6 孔板培育过夜。分别加入 0、10、20、30、40 mmol/ml 依维莫司，在药物作用 72 h后收集细胞，PBS冲洗细胞后，分别在避光条件下加入 Annexin V-FITC 试剂和 PI 试剂进行双染色 0.5 h。然后在 1 h 内上流式细胞仪进行检测。1.2.5 细胞迁移和侵袭试验 采用Transwell 小室试验检测细胞迁移和侵袭情况。选取药物处理 48 h 和药物未处理的 HGC-27 和 KATO III 细胞接种于 Transwell 小室的上室（迁移试验）或铺有基质胶的上室（侵袭试验），然后采

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