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第１３卷第３期２ ０ ０６ 年５月中国水产科学Ｊｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆＦ ｉｓｈ ｅ ｒ ｙＳ ｃ ｉｅ ｎ ｃ ｅ ｓｏ ｆＣ ｈ ｉｎ ａＶ ｄ ． １３Ｎ ｏ ． ３Ｍ ａ ｙ２０ ０ ６与鲤鱼抗寒性状相关的Ｒ Ａ Ｐ Ｄ 分子标记的筛选及其克隆梁利群１， 一， 高俊生２， 一， 李绍戊２， ． ， 孙效文２， 雷清泉１（ １． 哈尔滨理工大学， 黑龙江哈尔滨１５０ ０ ８ ０ ； ２． 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所， 黑龙江哈尔滨１５０ ０ ７ ０ ； ３． 大连水产学院， 辽宁大连１１６０ ２３； ４ ． 上海水产大学， 上海２０ ０ ０ ９ ０ ）摘要： 以黑龙江鲤（ Ｃ ｙ ｐ ｒｉｎ ｕ ｓｃａ ｒ ｐ ｉｏｈ ａ ｅ ｍ ａ ｔｏ ｐ ｔｅ ｒ ｕ ｓＴ ｅ ｍ ｍ ｉｎ ｃ ｋｅ ｔＳ ｃｈ ｌｅｇ ｅｌ）、 荷包红鲤抗寒品系（ Ｃ ｙ ｐ ｒｉｎ ｕ ｓｃａ ｒ ｐ ｉｏｖａｔ． 僦撇一ｎ ｅｎ ｓｉｓ）、 荷包红鲤（ Ｃ ｙ ｐ ｒｉｎ ｕ ｓ ｃａ ｒ ｐ ｉｏ ｖ ａ ｔ． ｗ ａ ｎ ａ ｎ ｅｎ ｓｉｓ）、 柏氏鲤（ Ｃ ｙ ｐ ｒｉｎ ｕ ｓｐ ｅｌｌｅｇ ｎ ｉｎ ｉ Ｔ ｃｈ ａ ｎ ｇ ）以及荷包红鲤抗寒品系和柏氏鲤的杂交Ｆ ２的Ｄ Ｎ Ａ 样品为材料， 用２０ ０ 个随机引物对其进行Ｐ Ｃ Ｒ 扩增， 获得了１个与鲤鱼抗寒性状相关的分子标记Ｒ Ａ Ｇ ２０ ， 并在Ｆ ２代分离个体中得到验证。 至此， 本实验室共获得ｌＯ 个与鲤鱼抗寒性状相关的分子标记， 更加证明抗寒性状是数量性状（ Ｑ Ｔ Ｌ ）受微效多基因控制。 此外， 将其中４ 个标记从琼脂糖凝胶上进行回收， 并与ｐ Ｍ Ｄ ｌ８ 一Ｔｖ ｅｃｔｏ ｒ连接， 将其转入感受态大肠杆菌Ｅ ． ｃｏ ｌｉ Ｄ Ｈ５ａ ， 对克隆片段进行序列分析， 旨为根据每～序列重新设计引物， 将Ｒ Ａ Ｐ Ｄ 标记转化为稳定的Ｓ Ｃ Ａ Ｒ 标记。 ［ 中国水产科学， ２０ ０ ６， １３（ ３）： ３６０ —３６４ ］关键词： 鲤鱼； 抗寒； ＳＣ Ａ Ｒ ； Ｒ Ａ Ｐ Ｄ ； 分子标记中图分类号： ｑｒ／８文献标识码： Ａ文章编号： １０ ０ ５—８ ７ ３７ 一（ ２０ ０ ６ ）０ ３—０ ３６ ０ —０ ５耐寒性状是鱼类的主要经济性状之一， 但是目前对鱼类耐寒机理的了解仍然不清楚。 王祖熊、 吴力钊等ｌｌ－ ４ ｊ一直致力于鲮鱼（ Ｃ ｉｒｒｈ ｉｎ ａ ｍ ｏ ｌｉｔｏ ｒｅｌｌａ ）低温耐受能力的研究。 孙效文等［ ５］５、 梁利群等【６Ｊ建立了适于抗寒分析的实验鱼体系用于鲤鱼抗寒问题的研究。 许多研究结果显示， 鱼类的不同地理种群在耐寒方面存在遗传上的差异， 如果能够找到体现这种差异的遗传标记， 就可能克隆与鱼类耐寒相关的基因， 将其用于一些不耐寒鱼类的遗传改良研究，有很重要的经济意义。随着现代分子生物学技术的不断发展， 尤其是多态性分子标记的应用， 为深入研究淡水鱼类的耐寒机制提供了新的方法。 本实验室自１９ ９ ６ 年开始研究鲤鱼的耐寒机制， 并首次应用分子标记技术， 获得了９ 个与鲤鱼耐寒性状相关的分子标记， 确定了抗寒性状是多基因控制的数量性状， 并将５Ｎ １４ ５１ｃ这一与鲤鱼抗寒性状相关的分子标记定位到鲤鱼的遗传连锁图谱上【７ － ８ ］。 本研究在此基础上对与鲤鱼抗寒性状相关的Ｒ Ａ Ｐ Ｄ 分子标记进行筛。 并将这些与抗寒相关标记的Ｐ Ｃ Ｒ 扩增特异片段进行回收、 克隆、 测序。 根据测序结果重新设计引物， 试图‘对其实施Ｓ Ｃ Ａ Ｒ （ Ｓ ｅｑ ｕ ｅｎ ｃｅＣ ｈ ａ ｒ ａ ｃｔｅ ｒ ｉｚ ｅ ｄＡ ｍ ｐ ｌｉｆ ｉｅ ｄＲ ｅｇ ｉｏ ｎ ｓ）标记转化， 以期获得能进行正常、 重复性好的Ｐ Ｃ Ｒ 结果， 并以此辅助鱼类抗寒育种的研究。１材料与方法１． １材料１． １． １实验鱼所用实验鱼为本实验室构建的适于鱼类抗寒研究的实验鱼体系。 分别为黑龙江鲤（ Ｃ ｙ ｐ ｒ ｉｎ ｕ ｓｃａ ｒ ｐ ｉｏｈ ａ ｅ ｍ ａ ｔｏ ｐ ｔｅ ｒ ｕ ｓＴ ｅ ｍ ｍ ｉｎ ｃ ｋｅ ｔＳ ｃｈ ｌｅｇ ｅｌ）、 荷包红鲤抗寒品系（ Ｃ ｙ ｐ ｒｉｎ ｕ ｓ ｃａ ｒ ｐ ｉｏｖ ａ ｒ ．ｗ ａ ｎ ａ ｎ ｅｎ ｓｉｓ）ｌ９ ｜、 荷包红鲤（ Ｃ ｙ ｐ ｒ ｉｎ ｕ ｓ ｃａ ｒ ｐ ｉｏ Ｖ ａｒ．ｚｖ ａ ｎ ａ ｎ ｅｎ ｓｉｓ）、 柏氏鲤（ Ｃ ｙ ｐ ｒｉｎ ｕ ｓ ｐ ｅｌｌｅｇ ｎ ｉｎ ｉ Ｔ ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ）以及荷包红鲤抗寒品系（ 父本）和柏氏鲤（ 母本）的杂交Ｆ ２。 由于荷包红鲤抗寒品系是由荷包红鲤和黑龙江鲤杂交得到的， 所以本实验也将其作为对照一起进行研究。 Ｆ ２代需要进行越冬实验， 在越冬前对所有个体进行标记， 同时采其部分鳍条组织， 提。 Ｎ Ａ 。 待越冬后， 将越冬存活个体取出， 根据对应的标记找到在越冬前提取的每一个体的Ｄ Ｎ Ａ ， 从这些个体Ｄ Ｎ Ａ 样品中抽取一部分混合在一起构成Ｆ ２代存活个体的Ｄ Ｎ Ａ 混合样， 从其余个体的Ｄ Ｎ Ａ 样品中抽取一部分混合在一起构成Ｆ ２代死亡个体的Ｄ Ｎ Ａ 混合样。１． １． ２主要试剂及实验仪器本实验所用随机引物来自美国Ｃ 忸ｍ 公司Ｊ匕京赛百盛公司和上海生工。 生化试剂购自美国陬硼罂公司， 其他试剂为国产分析纯。收稿日期： ２００５—０７ —１４； 修订日期： ２００５～１０一２４．基金项目： 国家“９７ ３” 基础研究项目资助（ ２００４Ｃ Ｂ ｌｌ７ ４０４）．作者简介： 梁利群（ １９６３一）， 女， 研究员， 硕士生导师， 从事水产动物基因组研究． Ｔ ｅｌ： ０４５１—８４８６１３１４； Ｅ － ｍ ａ ｉｌ： ｌｌｑ － ． １０１９＠ １６３． ｃｏ ｉｎ　　万方数据