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书书书新霉素磷酸转移酶基因狀狆 狋 Ⅱ的原核表达、蛋白 纯化 及其活性鉴定王　玲　刘 连盟　傅　强　黄世文（中 国 水稻研究所， 浙江 杭州３１０００６；通讯联系 人，Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ：ｓｗｈｕ ａｎｇ ６６６＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ）Ｐ ｒｏｋ ａ ｒ ｙ ｏ ｔ ｉ ｃ Ｅｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉｏｎ，Ｐｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉｏｎａｎｄ Ａ ｃ ｔ ｉｖ ｉ ｔｙ Ａ ｓ ｓａｙ ｏ ｆ Ｎ ｅｏｍｙ ｃ ｉｎ Ｐｈｏ ｓｐｈｏ ｔ ｒ ａｎ ｓ ｆ ｅ ｒ ａ ｓｅ Ⅱ（狀狆 狋Ⅱ）Ｇ ｅｎ ｅＷＡＮＧ Ｌ ｉｎ ｇ，Ｌ ＩＵ Ｌ ｉ ａｎ ｍ ｅｎ ｇ，ＦＵ Ｑ ｉ ａｎ ｇ， ＨＵＡＮＧＳｈ ｉ ｗ ｅｎ（犆犺 犻狀犪 犖犪 狋 犻狅狀 犪 犾 犚 犻 犮 犲 犚 犲 狊 犲犪 狉 犮犺犐狀 狊 狋 犻 狋狌 狋 犲， 犎犪狀犵狕犺狅狌３１０００６，犆犺 犻狀 犪；犆 狅 狉 狉 犲 狊狆狅狀犱 犻狀犵犪狌 狋犺狅 狉，犈 犿犪 犻 犾：狊狑犺狌犪狀犵 ６６６＠狊狅犺狌 ．犮狅犿）ＷＡＮＧ Ｌ ｉｎｇ，Ｌ ＩＵ Ｌ ｉ ａｎｍ ｅｎｇ，ＦＵ Ｑ ｉ ａｎｇ，ｅ ｔａ ｌ． Ｐ ｒｏｋ ａ ｒｙ ｏ ｔ ｉ ｃｅｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉｏｎ，ｐｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉｏｎａｎｄａ ｃ ｔ ｉｖ ｉ ｔｙａ ｓ ｓａｙｏ ｆｔｈ ｅｎ ｅｏｍｙ ｃ ｉｎｐｈｏ ｓ ｐｈｏ ｔ ｒ ａｎ ｓ ｆ ｅ ｒ ａ ｓ ｅ Ⅱ （狀狆 狋Ⅱ）ｇ ｅｎ ｅ． Ｃｈ ｉｎＪ Ｒ ｉ ｃ ｅ Ｓ ｃ ｉ，２０１１，２５（３） ：３２６ ３３０．犃犫 狊 狋 狉 犪 犮 狋： Ｎｅｏｍｙ ｃ ｉｎｐｈｏ ｓｐｈｏ ｔ ｒ ａｎ ｓ ｆ ｅ ｒ ａ ｓ ｅⅡ （狀狆 狋Ⅱ）ｇ ｅｎ ｅ，ｃ ｌｏｎ ｅｄｆ ｒｏｍａ ｐＣＡＭＢ ＩＡ １３０５ ｖ ｅ ｃ ｔｏ ｒ ｂｙ ＰＣＲ ｍ ｅ ｔｈｏｄ， ｗ ａ ｓｉｎ ｓｅ ｒ ｔ ｅｄｉｎ ｔｏａ ｐＥＴ ３０ａ（＋）ｖ ｅ ｃ ｔｏ ｒｔｏｃｏｎ ｓ ｔ ｒｕ ｃ ｔｔｈ ｅｒ ｅ ｃｏｍｂ ｉｎ ａｎ ｔｖ ｅ ｃ ｔｏ ｒｐＥＴ ３０ａ ｎｐ ｔⅡ ． Ｔｈ ｅｎｔｈ ｅｒ ｅ ｃｏｍｂ ｉｎ ａｎ ｔｖ ｅ ｃ ｔｏ ｒ ｗ ａ ｓｔ ｒ ａｎ ｓ ｆ ｏ ｒｍ ｅｄｉｎ ｔｏａｎ犈 狊 犮犺 犲 狉 犻 犮犺 犻犪犮狅 犾 犻 ｓ ｔ ｒ ａ ｉｎＢＬ ２１（ＤＥ ３）ａｎｄｔｈ ｅｅｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉｏｎｏ ｆｔｈ ｅ ＮＰＴⅡ ｐ ｒｏ ｔ ｅ ｉｎ ｗ ａ ｓｓｕ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｆｕ ｌ ｌｙｉｎｄｕ ｃ ｅｄｂｙａｄｄ ｉｎｇｉ ｓｏｐ ｒｏ ｐｙ ｌ βＤ ｔｈ ｉｏｇ ａ ｌ ａ ｃ ｔｏｐｙ ｒ ａｎ ｏ ｓ ｉｄ ｅ（ＩＰＴＧ）． Ｔｈ ｅ ＮＰＴⅡ ｆｕ ｓ ｉｏｎｐ ｒｏ ｔ ｅ ｉｎ ｗ ａ ｓｐ ｒｏｄｕ ｃ ｅｄｉｎｔｈ ｅｆ ｏ ｒｍｏ ｆｔｈ ｅｓｏ ｌｕｂ ｉ ｌ ｉ ｔｙｏ ｒｉｎ ｃ ｌｕ ｓ ｉｏｎｂｏｄ ｙｗ ｉ ｔｈ ｍｏ ｌｅ ｃｕ ｌ ａ ｒ ｗ ｅ ｉｇｈ ｔａ ｒｏｕｎｄ３５ ｋＤ，ａｎｄａｙ ｉ ｅ ｌｄｏ ｆａｐｐ ｒｏｘ ｉｍ ａ ｔ ｅ ｌｙ４５％． Ｔｈ ｅｉｎ ｃ ｌｕ ｓ ｉｏｎｂｏｄ ｉ ｅ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅｓｏ ｌｕｂ ｉ ｌ ｉ ｚ ｅｄａｎｄ ｄ ｅｎ ａ ｔｕ ｒ ｅｄｂｙａｄｄ ｉ ｔ ｉｏｎｏ ｆ５ ｍｍｏ ｌ／Ｌｄ ｉ ｔｈ ｉｏ ｔｈ ｒ ｅ ｉ ｔｏ ｌ（ＤＤＴ）ａｎｄ１％ ｓｏｄ ｉｕｍｌａｕ ｒｏｙ ｌｓａ ｒ ｃｏ ｓ ｉｎ ｅ（ＳＫＬ） ，ｔｈ ｅｎｒ ｅｎ ａ ｔｕ ｒ ｅｄｂｙｄ ｉ ａ ｌｙ ｓ ｉ ｓ． Ｔｈ ｅｓｏ ｌｕ ｂ ｉ ｌ ｉ ｚ ｅｄｐ ｒｏ ｔ ｅ ｉｎ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｐｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｅｄｂｙ Ｎ ｉ２＋ＮＴＡａ ｆ ｆ ｉｎ ｉ ｔｙｃｈ ｒｏｍ ａ ｔｏｇ ｒ ａｐｈｙａ ｔａｐｐ ｒｏｘ ｉｍ ａ ｔ ｅ ｌｙ９５％ ｐｕ ｒ ｉ ｔｙ． Ａｎ犻 狀狏 犻 狋 狉 狅 ａ ｓ ｓａｙｒ ｅｖ ｅａ ｌｅｄｔｈ ａ ｔ，ｔｈ ｅ ＮＰＴⅡ ｐ ｒｏ ｔ ｅ ｉｎｃ ａｎｉｎ ａ ｃ ｔ ｉｖ ａ ｔ ｅｔｈ ｅ ｋ ａｎ ａｍｙ ｃ ｉｎａ ｔｃｏｎ ｃ ｅｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉｏｎ ｓ ｕｐｔｏ３０μｇ／ｍＬ．犓 犲 狔 狑 狅 狉 犱 狊：ｎ ｅｏｍｙ ｃ ｉｎｐｈｏ ｓｐｈｏ ｔ ｒ ａｎ ｓ ｆ ｅ ｒ ａ ｓｅｇ ｅｎ ｅ；ｐ ｒｏｋ ａ ｒ ｙ ｏ ｔ ｉ ｃｅｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉｏｎ；ｉｎ ｃ ｌｕ ｓ ｉｏｎｂｏｄ ｙ；ｓｏ ｌｕｂ ｌｅ ｐ ｒｏ ｔ ｅ ｉｎ；ｐｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉｏｎ王　玲， 刘 连盟， 傅　强， 等． 新霉 素 磷酸转移酶基因狀狆 狋Ⅱ的 原核表达、 蛋白 纯化 及其活 性鉴定． 中 国 水 稻 科学，２０１１，２５（３） ：３２６ ３３０．摘　要： 通过ＰＣＲ方法从ｐＣＡＭＢ ＩＡ １３０５载体上克隆了 新霉素磷酸转移酶基因狀狆 狋Ⅱ的全编码序列 ， 并插入到原核表达载体ｐＥＴ ３０ａ（＋） 中 ， 构建了 重组质粒ｐＥＴ ３０ａ ｎｐ ｔⅡ。 将重组质粒转化大肠杆菌ＢＬ ２１（ＤＥ ３） 宿主菌， 经ＩＰＴＧ诱导， 获得了 相对分子量为３５ ｋＤ的表达蛋白 ， 约占 全菌总蛋白 的４５％。 表达蛋白 以 可 溶性和 包涵 体两种 形式存在。 用５ ｍｍｏ ｌ／Ｌ二硫苏 糖醇和１％十二烷基肌氨酸钠变性溶解包涵体， 经透析后复性获得了 可 溶性重组 蛋白 。 将可 溶 的 表达蛋白 用Ｎ ｉ２＋ＮＴＡ亲 和 层析纯化， 获得纯化的ＮＰＴⅡ蛋白 ， 电 泳谱带扫描分析表明 蛋白 纯度达９５％以 上。 体外活性检测 显示，ＮＰＴⅡ蛋白 具有 良 好的生物活性， 在浓度３０μｇ／ｍＬ以 上时可使卡拉霉素失去抑菌活性。关键词 ： 新霉素磷酸转移酶基因 ； 原核表达； 包涵体； 可溶性蛋白 ； 纯化中 图 分类号： Ｑ ９４３ ．２；Ｓ ５１１ ．０３　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　文献标识码： Ａ　 　 　文章编号：１００１ ７２１６（２０１１）０３ ０３２６ ０５　 　新 霉 素 磷 酸 转 移 酶 基 因 （ｎ ｅｏｍｙ ｃ ｉｎ ｐｈｏ ｓｐｈ ｏ ｔ ｒ ａｎ ｓ ｆ ｅ ｒ ａ ｓ ｅｇ ｅｎ ｅ，狀狆 狋Ⅱ） ， 来 自 大 肠 杆 菌 转 座 子Ｔｎ ５ 上 的犪狆犺犃２基 因 。该基因 编码氨 基糖苷３ ′ 磷酸转 移 酶（ＮＰＴⅡ） ， 能 使 氨 基糖苷类抗生素（卡拉霉素、新霉素、Ｇ ４１８和 庆大霉 素 等） 磷酸化而失活［１］。 ＮＰＴⅡ使ＡＴＰ分子上的γ 磷酸基转移到抗生素分子上， 影响抗生 素 与 核 糖体亚 基的 结合， 从 而 使 抗 生 素 失活。 因 此， 在转基因 作物遗传转化过程中 ， 将狀狆 狋Ⅱ基因 作为选择标记基因 与目 标基因 一同 导入作物， 可使转化 成功 的 植株产生抗生素抗性， 以 有利于转基因 作物的筛选。作为 目 前最广泛 的 抗 生 素 选 择 标 记 基 因 之一［２］，狀狆 狋 Ⅱ基因 已 被广泛应用于水稻、玉米和 棉 花等多种 转基因 抗虫 或抗除草剂作物中 。 据统 计，２００１ 年 和２００２ 年 美 国 批 准田 间释放试验 的１９７０ 例 转 基 因 作 物 中 ， 含 有狀狆 狋 Ⅱ基 因 的 占４８ ．２％［３］。 尽管有研究表明 ， 卡拉霉素抗性基因 及其编码产物是安全的［４ ５］， 但是人们 担心 转基因 作 物 中 抗 性 基因 会转移到微生物、动物或其他植物中 ， 使其产生抗性［６ ８］。 前人的研究也表明 ， 转基因 作物中 的狀狆 狋Ⅱ基因 能够向 叶围 细 菌、土壤细菌以 及共生的黑曲 霉中 漂移［９ １１］。 因 此， 有必要进一步对狀狆 狋Ⅱ基因 及其表达产 物 进 行跟踪 检测， 为 其生 态 安 全性提供全面客观的评价。　 　对狀狆 狋Ⅱ表达产物的检测， 最初使用点 杂 交、层析法和 凝胶原位检测 法［１２］， 其 基 本 原 理 是 使 用 放 射 性 标 记 的 ［３２Ｐ］ＡＴＰ， 通过磷酸基团 转 移， 生 成 放 射 性 的 卡 拉 霉 素。 但 这３种方法操作烦琐， 检测 时使用 大量的 ［３２Ｐ］ＡＴＰ会造 成环 境污染， 而且很难 进 行大批 量 样 品 的 检测［１３］。 目 前 普 遍 使 用酶联免疫吸附技术（ＥＬ ＩＳＡ） 对ＮＰＴⅡ蛋白 进 行检测［１４］， 它具有快速、简单、不使用放射性标记的优点 ， 且可对ＮＰＴⅡ蛋白 进行定量测定， 但抗原抗体的 免疫反应易 受 到 多 种 因 素 的影响， 如 作 物 体内 的 多 酚、 某 些 酸性 物 质 和ｐＨ值会干 扰 抗收稿日 期：２０１０ ０８ １７； 修改稿收到日 期：２０１０ １１ ０１。转 基 因 生 物 新 品 种 培 育 重 大 专 项 资 助 项 目基 金 项 目 ：（２００９ＺＸ ０８０１２ ０１０Ｂ，２００８ＺＸ ０８０１２ ０４，２００８ＺＸ ０８００１ ００２） ； 中 央 级公益性科研院所专项基金资助项目 （２００９ＲＧ ００４ ４） 。６２３中 国 水稻科学（犆犺 犻狀犑 犚 犻 犮 犲 犛 犮 犻） ，２０１１，２５（３） ：３２６～３３０ｈ ｔ ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ ｉ ｃ ｅ ｓ ｃ ｉ．ｃｎＤＯ Ｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉ ｓ ｓｎ．１００１ ７２１６．２０１１．０３．０１５