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瑚鲫『1jII芒l2 345P53268bpD-actin 453bi：靴鲫∞∞，-{石斛合剂对糖尿病模型大鼠胰岛细胞凋亡及P５３mRNA 表达的影响高尤亮 １ ,施 　 红 ２ ,杨秀珍 ３ ,余文珍 ２ ,郑燕芳 ２ ,王晓宁 ２(１．福建中医药大学附属第二人民医院病理科 　 福建 　 福州 。常担埃埃埃 ;２．福建中医药大学中西医结合学院 　 福建 　 福州 。常担埃保埃 ;３．江苏省泰州市人民医院内科 　 江苏 　 泰州 。玻玻担常埃 )基金项目:国家自然科学基金资助项目( ８１０７２７３６ );福建省自然科学基金资助项目(C５１００２５ )摘要:目的 　 研究石斛合剂对高糖高脂 ＋STZ 造模糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡及相关基因 P５３mRNA 表达的影响.方法 　 大鼠高脂高糖饲养 １ 月后腹腔注射 STZ 制备糖尿病模型,经石斛合剂治疗 ２ 周后检测胰岛细胞凋亡及 P５３mRNA 表达.结果 　 石斛合剂可显著地降低糖尿病大鼠空腹血糖( P ＜０．０５ 或 P ＜０． ０１ );显著减少糖尿病模型大鼠胰岛细胞凋亡( P ＜０． ０５ ),减少 P５３mRNA 表达( P ＜０． ０５ ).结论 　 石斛合剂降低血糖,减少大鼠胰岛细胞凋亡,其可能与其降低糖尿病模型大鼠胰腺组织 P５３ 表达有关.关键词:石斛合剂;细胞凋亡;糖尿病;大鼠【中图分类号】 R４５３　　　　　　 【文献标识码】 B　　　　　 【文章编号】 １６７１－０２８２ ( ２０１６ ) ０６－０３７０－０２　　 糖尿病患病率逐年上升,流行病学调查表明,全国 ≥２O 岁人群DM 患病率为 ９． ７％ ,且糖耐量异常人群远远超过确诊的 DM 患者[ １ ] .开发治疗糖尿病中药,临床应用前景可观.本课题组既往研究证实石斛合剂能显著降低实验动物高血糖,调节胰岛素分泌、升高胰岛素/ C 肽比值,降低血酯、FFA 水平,且应用于临床后证实该方降糖疗效确切.本研究通过建立高糖高脂 ＋STZ 造模糖尿病大鼠模型,观察石斛合剂对胰岛细胞凋亡及凋亡相关基因 P５３ 表达的影响,探讨其治疗糖尿病的机制.１　 材料与方法１． １　 实验动物及药物、试剂 　 清洁级健康 Wistar 大鼠 ５０ 只(上海斯莱克实验动物有限公司),３ 月龄,雌雄各半,体重 １４０~１６０g .石斛合剂(福 建 中 医 研 究 院 药 厂 制 备,批 号: ０１０６１５ ,生 药 含 量: ２．０g ?mL－１ ). STZ (Sigma 公司美国);血糖试剂盒(南京建成); Oligd ( T )(上海博亚); M－MuLV 反转录酶( Fermentas 公司美国); TRIZOL 、DEPC 、 PCR 引物、 TaqDNA 聚合酶(上海生工).１． ２　 分组及给药方法 　Wistar 大鼠 ５０ 只,适应性喂养 １ 周,随机分为正常对照组 １０ 只、糖尿病模型组(模型对照组 １０ 只、石斛合剂低、中、高剂量 组 各 １０ 只).大 鼠 高 脂 高 糖 饲 养 １ 月 后 腹 腔 注 射 STZ( ３０mg )制备糖尿病模型.正常对照组:给予 NS 灌胃( ０． １mL ?kg－１ )２ 周;模型对照组:给予 NS 灌胃( ０．１mL ?kg－１ )２ 周;石斛合剂低、中、高剂量组:石斛合剂７． ５ 、 １５ 、 ３０g ?kg－１ 灌胃 ２ 周.实验过程模型组死亡 ２ 只,各剂量组各死亡一只.实验结束后用乙醚麻醉,腹主动脉取血,并取胰腺组织备测.１． ４　 观察指标及检测方法１． ４． １　 一般情况观察及生化指标检测 　 观测大鼠进食量、饮水量、精神状态、毛色、活动及排尿量、每周体重改变.空腹血糖( FBC )采用葡萄糖氧化酶法测定.１． ４． ２　TUNEL 法检测细胞凋亡 　 胰腺组织石蜡包埋 ３ μ m 连续切片.常规 脱 腊、水 化,蛋 白 酶 K 室 温 孵 育 １５min . ３％ H ２ O ２ 孵 育１０min ,高压修复 ２min ,血清封闭 ２０min ,后加 ５０ μ L 的 TUNEL 反应混合溶液,湿盒中 ３７℃ 孵育 ６０min , PBS 冲洗,滴加转化剂 POD , ３７℃孵育 ３０min ,每张切片加 １００ μ LDAB 液,显微镜下控制染色时间.阴性对照用 PBS 代替 TUNEL 反应液.结果判定:细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性.切片于 ２０ 倍物镜下观察,计算每个胰岛内凋亡细胞数.１． ５　 统计学方法 　 数据资料采用 SPSSforWindows１９ 统计软件包进行统计,结果用表示,多组间比较采用单因素方差分析, ２ 组间比较用 t 检验.检验水准 α＝０．０５ .２　 结果２． １　 石斛合剂对糖尿病模型大鼠空腹血糖的影响 　 与模型对照组血糖 ２９．３５±３． ２４mmol ? L－１ 比较,石斛合剂治疗各剂量组血糖(２３． ９７±１． ２４ 、 ２０． ９３±４． ３８ 、 ２３． １６±４． ０６mmol ? L－１ )均有显著性下降(P ＜０． ０５ 或 P ＜０． ０１ ),但未降至正常( ４． ９９±０． ９２mmol ? L－１ P ＜０．０１ ),治疗各剂量组之间差异无统计学意义( P ＞０．０５ ).２． ２　 石斛合剂对大鼠胰腺细胞凋亡的影响 　 与正常对照组( ０． ９０±０．４３ )比较,糖尿病模型大鼠胰岛凋亡细胞数量( ３． ３７±１． ５１ )增加( P ﹤０． ０１ ),石斛合剂治疗各剂量组( １． ８８±１． ０３ 、 １． ３３±１． ００ 、 １． ６７±０． ９４ )与模型组比较,凋亡细胞数量显著减少( P ＜０．０５ ).治疗各剂量组间比较,差异无统计学意义( P ＞０．０５ ).２． ３　 石斛合剂对各组胰腺 P５３mRNA 表达的影响 　 与正常对照组比较,模型组 P５３mRNA 表达升高( P ＜０． ０５ ).石斛合剂治疗后各剂量组 P５３mRNA 表达减少( P ＞０．０５ ).与正常对照组表达无关异( P ＞０． ０５ ),中高剂量治疗组与模型组比较, P５３mRNA 表达显著降低( P ＜０． ０５ ).结果见表 １ 及图 １ .表 １　 石斛合剂对各组 P５３mRNA 表达比较组别 例数 灰度比正常对照组１０ １． １４±０． ２１模型对照组８ １． ４５±０． １４△石斛合剂低剂量组９ １． １２±０． ２９石斛合剂中剂量组９ １． ０８±０． １９＊石斛合剂高剂量组９ １． １２±０． ２１＊　　 注:与 A 组比较,△ P ＜０．０５ ,△△ P ﹤ ０．０１ ;与 B 组比较＊ P ＜０．０５ ,＊＊ P ﹤ ０．０１图 １　 各组大鼠胰腺 P５３mRNA 的表达　。 :正常对照组; ２ :模型对照组; ３ :石斛合剂低剂量组; ４ :石斛合剂中剂量组; ５ :石斛合剂高剂量组. ６×loadingbuffer２μ l , P５３ 和 β －actinPCR 产物各 ５ μ l ; １００V , ３０min ,曝光时间 ４s .３　 讨论目前,国内外学者认为糖尿病的发病机制与胰岛 β 细胞凋亡密切相关.不论是 １ 型或 ２ 型 　 (下转第 ３７４ 页)