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    188宝金博页面版: 原位末端标记(TUNEL)法、流式细胞仪PI法和PI、Annexin V双标记法检测细胞凋亡的比较

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    内容提示： 中国 微 循 环1 9 9 9年3月 第3卷第1期·实 验 研 究·原 位末端标 记( T U N E L )法、流 式 细胞 仪 P I 法 和P I、An n ex inV双 标 记 法 检 测细胞 凋 亡 的 比 较田涛吴朝 晖 金 惠 铭近 年来,细 胞凋亡的 研究 引 起 了人 们 广 泛 的 重视。人 们 发 现 有些 心 血 管 系 统 的疾 病 与 细 胞 凋 亡 有关。在微 循 环 障碍 时,微 血管 内 皮 细 胞 的 凋 亡 与 微 血管病、血栓 性 疾 病 的 关 系 也 引 起 了重视 lj [。因 此 如 何 选 择适 当的 方法检测 细 胞 凋 亡成 了 大 家感 兴趣 的问 题。目 前 研究 细 胞凋 亡 的 方 法 有 多 种...

    文档格式：PDF | 页数：3 | 浏览次数：162 | 上传日期：2016-09-05 13:58:46 | 文档星级：
    中国 微 循 环1 9 9 9年3月 第3卷第1期·实 验 研 究·原 位末端标 记( T U N E L )法、流 式 细胞 仪 P I 法 和P I、An n ex inV双 标 记 法 检 测细胞 凋 亡 的 比 较田涛吴朝 晖 金 惠 铭近 年来,细 胞凋亡的 研究 引 起 了人 们 广 泛 的 重视。人 们 发 现 有些 心 血 管 系 统 的疾 病 与 细 胞 凋 亡 有关。在微 循 环 障碍 时,微 血管 内 皮 细 胞 的 凋 亡 与 微 血管病、血栓 性 疾 病 的 关 系 也 引 起 了重视 lj [。因 此 如 何 选 择适 当的 方法检测 细 胞 凋 亡成 了 大 家感 兴趣 的问 题。目 前 研究 细 胞凋 亡 的 方 法 有 多 种,如D N A碎 片 的电泳( 梯形电 泳 )、电 镜 观察 ( 核 固 缩、凋 亡 小体 ) 等。流 式 细 胞 术(f l o wey tome t r y) 以 其方 便、快速、灵 敏、准 确 的 优 点,被 广 泛 应 用 于 细 胞 凋 亡 的 检 测 图。原 位 末 端 标 记( T U N E L ) 法 3 [ ]也 倍 受 关 注。本 文 以 成肌 细 胞为标本,应用T U N E L法、流式细 胞 仪P l法 和P l、An n e xi n V双 标 记法 检测 了 成肌 细 胞 的 凋 亡 百 分 率,比 较 了三 种方法 的 检 测 结 果,讨 论 各 种方 法 的特点,试 图 寻找检测细 胞 凋亡 的有效方 法。材 料 与 方 法1大 鼠成 肌 细 胞 凋 亡 模 型的 建立 和 细 胞悬 液 的制备Tew:a j [ 发现骨骼肌萎 缩时,成 肌 细 胞发 生细 胞 凋亡。我们采 用切 断一 侧 臂 丛神 经 的方 法 造 成 大 鼠骨骼肌萎 缩,将 上 肢 部分 胧 三头 肌 ( 萎 缩 和 正 常 ) 肌 肉 用1 0 % 中性 福 尔马 林 固 定,制 成 石 蜡 切 片。另 一 部分 制成细胞悬液。细 胞 悬液 的制 备参 照 lB a unm 闭 的 方法并加 以 改进。具 体 方法 如 下:取 肌 肉 组织0.s e m3 ,用D一Ha nk s液漂 洗干净,4 ℃ 下剪 碎,D一Ha nk,液 漂 洗并 去 上 清 及漂 浮组织,0.2 5 % 胰酶 消化 2 0 一 4 0 分 钟,随 时 吸一 滴镜 下 观察,当 镜 下 出 现 较多 单个成肌 细胞时,用 1 0 %小牛 血清终 止 消化。5 0 0转 / 分 离心 3 0 秒,收 集 上 清液,将上清 液 用1 5 0 0 转 / 分 离 心 5分 钟,去 上 清,悬 浮于Z m l D一Ha nk s液中。2流 式 细 胞仪检 测将 已 制成 悬 液 的成肌 细 胞数调 至l ~ s x l o`/ m l左 右。p l 法 加 入荧 光 染 料 碘 化 丙 陡 ( P l ) 5 0 拌 l ( 5 0 拌 g /m l );An n e xi n V 和 P l 双 标记法 各加 入 An n e xi n V 和l P 至 终 浓 度1 拌g / m l。然 后 应 用流 式 细胞仪 ( F a csC a l-i b ur,美 国Be e t o nD i e k i ns o n公 司 ) 对 标 本 进行 检 测。I P 法 记录 激 发波 长48 8 n m 处 的 红 色 荧光,输 入 计 算机运用 M O D F IT I,T f orma c vl.0 1 和 C E IJIJQ U E S T 软件分 析5 0 0 0 个 细 胞 中 各个 细 胞周期的 百 分率,并打印出凋 亡 细胞 峰。Ane ni xnV 和I P 双 标记 法 采 集 红 色 荧光 和 绿 色 荧光,输 入 计 算机,采 用c E L L Q u E s T软 件分析后,以 散 点 图 ( do tp l o t ) 的 形 式 打 印。3 T U N E L 法 检 测 细 胞 凋亡 阁制备 骨 骼肌 横 切面的 石 蜡 切片。T U NI EJ试 剂盒购 自 o Bri n ge r。阳 性 对 照 用 D Na s el ( l m g / m l ) 消 化 1 0分 钟 后 加 入T U N E L反 应 混 合 液;阴 性 对 照 在·T U N E L反应 混 合液 中 只 加入 标 记 液。操作 步 骤 如下:. 3 1石 蜡 切 片 系 列 酒 精脱蜡。3·2 2 0 拌 g / m l 蛋 白 酶 k 3 7` C消 化3 0 分 钟。3.3P B S洗2次 后,在 冰 上 加0.1 % 的 Tri to n-1 0。柠 檬 酸钠2 分钟。3.40.3 % HZ O :甲 醇 室 温 3 0 分 钟。3.5 p B S洗z次 后,加5 0拌 I T U N E L反 应 混 合液,湿盒 内 3 7` C3 0 分钟。3.6P B S洗3次 后,加5 0 拜 I T U N E L P O D,湿 盒内3 0 分 钟。3.7P B S洗3次 后 加5 0拌 1 P O D底 物D A B。3.8水洗,封 片,4 0 0倍视 野 下每 个 切片 取 1 0个视 野 ( 每个 视 野 面 积 为1 少 拌 mZ ),计 数1 0 个 视 野 的 阳性 细 胞百分数,取 其平均数。4统计方法数 据 资 料 用 均数 士 标 准 差 表 示。统计方 法采 用 配对t检验,以 尸 <0.0 5 为有显 著 性 差异。并对 三种 方 法检测 结果进行直线相 关 分析。结 果作 者 单 位:2 0 0 0 3 2上 海 医 科 大 学 病 理 生 理 教 研 室我 们采用流 式 细胞 仪 l P 法、Ane ni xnV 和lP 双标记 法、T U N E L法 三 种方法 检测 了 成肌 细 胞 的 凋 亡百分率。失 去神 经 支配 后 肌萎 缩 时成肌 细胞 凋 亡 百 分率增高 ( 表2 )。三种 方 法 检测 结果 有 显 著性 差 异,P I法阳 性率最 低,T U N E L法较高,A: I n e xi n V、P l 双 标 记

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