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    188宝金博页面版: 基因工程中常用的酶及其功能分析

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    内容提示： 基因工程中常用的酶及其功能分析 [摘 要] 酶是活细胞所产生的一种具有特殊催化功能的蛋白质,在生物工程中应用非常广泛,如食品、医药、废水处理等方面.基因工程中常用的酶主要包括核酸酶、连接酶、聚合酶和修饰酶,分别发挥着不同的功能. [关键词] 基因工程;基因克隆;DNA. 外源基因通过体外重组后需要导入受体细胞内,在受体细胞内复制、转录、翻译并表达的操作过程称为基因工程(Gene Engineering)[1].其中基因克隆是不可缺少的步骤.在基因克隆过程中,当目的 DNA 样品制备好之后,需要对 DNA 分子进行进一步的处理,包括对目的基因片段的取得、连接、转化...

    文档格式：PDF | 页数：2 | 浏览次数：83 | 上传日期：2019-07-31 04:19:00 | 文档星级：
    基因工程中常用的酶及其功能分析 [摘 要] 酶是活细胞所产生的一种具有特殊催化功能的蛋白质,在生物工程中应用非常广泛,如食品、医药、废水处理等方面.基因工程中常用的酶主要包括核酸酶、连接酶、聚合酶和修饰酶,分别发挥着不同的功能. [关键词] 基因工程;基因克隆;DNA. 外源基因通过体外重组后需要导入受体细胞内,在受体细胞内复制、转录、翻译并表达的操作过程称为基因工程(Gene Engineering)[1].其中基因克隆是不可缺少的步骤.在基因克隆过程中,当目的 DNA 样品制备好之后,需要对 DNA 分子进行进一步的处理,包括对目的基因片段的取得、连接、转化等操作.而这些操作过程必须借助酶(enzyme)的重要作用才可完成.由于研究方向及目的不同,现在对酶的分类方法也各不相同.结合实验,从基因工程的角度可将酶分为如下几类:①核酸酶,②连接酶,③聚合酶,④修饰酶. 1 核酸酶 核酸酶(nuclease)是一类以核酸为底物的水解酶 ,它可以打断核酸链中的磷酸二酯键 ,因而在基因工程中应用非常广泛.按底物专一性可以将核酸酶分为核糖核酸酶 (RNase)与脱氧核糖核酸酶(DNase),非专一性核酸酶等.其中 RNase 降解 RNA 分子,DNase 降解 DNA 分子.但它们都可以分为两类:核酸外切酶(exonuclease)和核酸内切酶(endonuclease). (1)核酸外切酶:从 DNA 两端向中间切割,可分为 2 种情况:一种是切下一条链的末端,另一种情况是从两端同时向中间切. (2)核酸内切酶:从DNA链的内部进行切割,分为限制性内切酶和非限制性内切酶.2种酶由于识别的目的片段不同,因此功能有差异.现在这 2 种酶在基因工程中的作用都很大,例如非限制性内切酶中的 DNaseI,它对单双链都很敏感,可以在 DNA 中任何部位切断磷酸二酯键,无特异识别位点.限制性内切酶(restriction endonucleae)是一种能识别和切割双链 DNA 分子内特定核苷酸序列的酶,多在原核生物中存在,在基因工程中的主要用途是通过切割 DNA 分子,对含有特定基因的序列进行分离进而分析.它分为 3 类:Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类.对于Ⅰ和Ⅲ类酶,在同一蛋白中兼有甲基化酶的功能并依赖于 ATP限制性内切酶的活性.其中Ⅲ类酶在其识别位点上切割 DNA,然后从底物上解离下来;Ⅰ类酶结合于特定识别位点,但酶切位点不是十分固定,对其识别位点进行随意切割,因此在基因工程中应用范围非常有限[2].在基因工程中应用广泛的是第Ⅱ类,Ⅱ类限制-修饰酶系统是由 2 种酶分子组成的二元酶系统:一种为限制性内切酶,一种为独立的甲基化酶,它修饰与限制性内切酶识别位点相重叠的序列.具有如下特点: (1)识别特异核苷酸序列,起长度为 4 或 5 个,但有少数酶识别更长的序列或兼并序列. (2)具有特定酶切位点,在其特定的识别位点对 DNA 进行限制性内切.在进行酶切时,可产生特殊的平端和粘性末端,可以通过碱基配对连在一起,在基因工程中有重要的意义.但限制性内切酶在应用时受很多条件的限制,如 DNA 纯度、DNA 甲基化程度、反应温度的影响[3]. 2 连接酶 连接酶(ligase)一般用于将两段或数段 DNA 片段拼接起来,基因工程中最常用的连接酶是 T4 DNA 连接酶、E.Coli DNA 连接酶和 T4 RNA 连接酶.其中又以 T4 DNA 连接酶最重要,DNA5’端磷酸基与 3’端羟基之间形成磷酸二酯键[4].其主要用途为: (1)连接带匹配粘性末端的 DNA 分子.DNA 重组实验中,往往优先选择粘性连接.如果得到的DNA 片段不是粘性末端,可采用如衔接体技术、接合体技术等方法使之成为粘性末端,然后再进行连接,以提高反应效率. (2)使平端的双链 DNA 分子相互连接或与已合成的寡聚核苷酸接头相连,但这个反应连接效率要低一些.同样对连接酶来说影响因素也很多,实际最佳连接温度要比理论连接温度低得多.在实验中可根据实际情况(如 G+C 的含量)适当改变连接温度. 3 聚合酶 聚合酶(polymerase)以 DNA 或 RNA 为模板催化合成互补新链,需要相应的一个引物来引起聚

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