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毒理学杂志２ ０ ０ ８ 年６ 月 第２ ２ 卷第３期Ｊ７ｒ缸ｉｃｏ ｌ Ｊｕ ｎ ｅ ２ ０ ０ ８ｖ ０ １． ２２Ｎ ｏ ． ３中图分类号： Ｒ ９ ９ ４ ． ３文献标识码： Ａ文章编号： １０ ０ ２—３１２７ （ ２０ ０ ８ ）０ ３一０ ２１６ 一０ ３三聚氰胺的毒性研究?实验研究?林祥梅１， 王建峰１” ， 贾广乐１， 梅林１， 王众１（ １． 中国检验检疫科学院动植物检疫研究所， 北京１０ ０ ０ ２９ ； ２． 南京农业大学动物医学院）关键词： 三聚氰胺； 细胞毒性实验； 急性毒性； 亚急性毒性实验； 肾衰竭２０ ０ ７ 年３月 中旬以来， 美国发生４０ ０ ０ 多起猫、 狗等宠物中毒死亡事件¨ 。 ２１。 美国食品药品管理局从进口的部分小麦蛋白粉和大米蛋白粉中检出三聚氰胺等成分。 三聚氰胺多用于生产塑料和肥料， 还可制造药物胶囊１３。 ５１。 在动物饲料中添加三聚氰胺， 可提高饲料的氮含量， 让人误以为该饲料的蛋白质比较丰富， 但目前还没有被认定有害人体健康， 有关它和其他物质混合后对动物产生何种影响的资料报道甚少。 本试验通过对三聚氰胺的细胞毒性、 急性毒性和亚慢性毒性研究， 客观评价动物长时间接触该化合物的：π， 以及为中毒动物的治疗提供理论基础。１材料与方法１． １材料Ｂ Ｈ Ｋ 细胞（ 由中国人民解放军事医学科学院提供）； 昆明小鼠， 清洁级， 体重１８ ｇ 一２ ２ ｇ ， 雌雄各半， （ 购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心）； 成年健康猫（ 购自北京大学医学部实验动物中心）。１． ２主要仪器与试剂三聚氰胺（ 北京化学试剂公司）， Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ 培养液， 胎牛血清（ 美国Ｇ ＩＢ Ｃ Ｏ 公司），Ｍ ｒＩ’ Ｉ’ 溶液（ 美国Ｓ ｉｇ 眦公司）， 倒置相差显微镜（ Ｄ ｍ ｉｌ型， 美国ｌｅｉｃａ 公司）， 酶标仪（ Ａ ｃｃｅｎ ｔ型， 美国ｒ１１Ｉｌｅｒ啪公司）， ｃＯ ， 培养箱（ ３１ｌｌ型， 美国ｎ ｅｎ ｎ ｏ 公司）， 生化分析仪（ ｓａ ｂ ａ ｌ８ 意大利）， 石蜡切片机（ ｋ ｉｃａ 美国）。１． ３方法１． ３． １三聚氰胺对Ｂ Ｈ Ｋ 细胞的毒性试验： 将三聚氰胺用培养液加热搅拌溶解， 甘油助溶， 配成５ ｍ ∥ ＩＩｌｌ的溶液然后在无菌条件下进行３倍稀释备用。 将对数生长期的Ｂ Ｈ Ｋ 细胞消化、 计数， 用含体积分数为１０ ％的胎牛血清的Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ 培养液配成浓度为５× １０ ４ 个／ＩＩｌｌ的细胞悬液， 按２０ ０ “ｌ／孔的密度接种于９ ６孔培养板， ３７℃、 ５％Ｃ Ｏ ： 温箱培养使细胞贴壁。 ２４ｈ 后弃去旧培养液， 加入不同浓度的样品２０ ０ 出， 每个稀释度作５个平作者简介： 林祥梅， 副研究员， 研究方向： 动物检疫。行孔， 继续培养２０ ｈ 后加入Ｍ １Ｔ ｒ ， 每孔２０ “ｌ， 再培养４ｈ ， 弃去液体后加入１０ ０ “ｌ Ｄ Ｍ Ｓ Ｏ 震荡１０ｍ ｉｎ ， 立即在酶标仪５７ ０ ｎ ｍ 波长处测各孔Ａ 值。 同时设对照组。 重复上述实验三次。细胞活力存活率％＝ （ （ 样品Ａ 值一空白组Ａ值）， （ 阴性对照Ａ 值一空白组Ａ 值）× １０ ０ ％。１． ３． ２三聚氰胺的急性毒性试验： 称取需要的三聚氰胺量， 用研钵研磨后加蒸馏水到所要求的浓度。 选择健康小鼠， 采用灌胃方式从低剂量给药， 每组６ 只小鼠（ 雌雄各半）， 观察４ ８ｈ 。 小鼠死亡后剖解观察。１． ３． ３三聚氰胺的亚慢性毒性试验： 将试验猫随机分为２组， 每组３只， 按照美方提供的饲料中三聚氰胺含量为２． ４ ｇ 进行添加， 采用３０ ｄ 连续喂养试验， 并于饲喂后第６、 ９、 １５、 ２３、 ３０ ｄ 采血做生化指标检查。 实验结束后将实验猫处死， 取肾脏固定于体积分数为５％的甲醛中ｌ。 ３ ｈ ， 常规石蜡制片。１． ４ 统计学方法ＩＣ ∞是将细胞存活率对浓度对数作图， 按作图法用Ｅ Ｄ ５０ａ ｎ ｄ ＩＣ ５０Ｆ Ｏ ＲＧ ｍ ｄ ｅ ｄＲ ｅ ｓｐ ｏ ｎ ｓｅ （ Ｖ ｅ ｒ１． ２， 日本Ｈ ． ０ ｎ ｏ 开发）程序计算出ＩＣ ∞。２结果２． １Ｍ １Ｔ ｒ 法测定结果不同浓度的样品对Ｂ Ｈ Ｋ 细胞作用２４ ｈ 后， Ｍ Ｔ Ｔ 法测定Ａ ， ∞， 计算细胞的存活率， 结果见表ｌ。 统计分析结果表明， 三聚氰胺在高浓度时（ ≥１． ６６７ ｍ ∥ ＩＩｌｌ）与细胞存活率显著相关（ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５），计算ＩＣ ∞为ｌＯ ． １ｌ ｍ ｇ ／ｒｒＩｌ。２． ２三聚氰胺急性毒性实验结果最高剂量组给药后９ｈ ， 小鼠开始出现不安， 呼吸急促， 随后在几十ｍ ｉｎ内死亡。 其他剂量组小鼠仅见精神不振， 反应迟钝， 闭眼伏卧， 不食等症状， 随后在２４ —４ ８ｈ 出现个别死亡。灌胃死亡的小鼠输尿管中均有大量晶体蓄积， 部分小鼠肾脏被膜有一层晶体。 其他脏器未见有明显的变化。 三聚氰胺急性毒性实验小鼠死亡情况见表２， 三聚氰胺的全部不致死的最大剂量大于５０ ０ ０ｎｌｇ ／ｋ ｇ 。　万方数据