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98猪业科学? ? SWINE? INDUSTRY? SCIENCE? ? 2014年? 第8期猪群保健H E A L T H猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立王洪光1， 汤德元1*， 曾智勇1， 罗险峰2， 李春燕1， 郝 飞1， 刘 建1， 李 达1（1.贵州大学动物科学学院， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省动物疫病预防控制中心， 贵州 贵阳 550008）随着现代养猪业规模化和集约化的发展， 猪群发生多种病原混合感染和继发感染的情况越来越普遍， 猪病的复杂程度及其：σ灿肴 俱增。 目 前， 猪呼吸道疾病是影响养猪业发展的主要疾。 也是我国规模化猪场的常发病、 多发。 已经引 起人们的普遍重视， 给我国养猪业带来极大的经济损失。 在猪场常发生的各类病毒性呼吸道疾病中，PRRSV 和 SIV 等是最为多见的病原[1]。PRRSV 和 SIV 引起的猪呼吸道疾病主要以发热、 咳嗽、 气喘、 呼吸困难、 眼鼻分泌物增多、 食欲减退、 迅速消瘦等为特征 ； 同时 PRRSV 还是引起妊娠母猪发生流产， 产死胎、 木乃伊胎、 无活力弱仔、 畸形胎， 少仔和不育的猪繁殖障碍性疾病的主要病因之一[2-3]。 自Mullis1983 年建立 PCR 技术以来， 该方法不断得到发展， 目 前已成为当今动物疫病检测和诊断中最具应用价值的方法， 该方法广泛应用于分子应用生物学及其相关领域[4]。 mPCR 是指在同 一PCR 反应体系中使用多套引 物， 针对多个核酸模板或同一模板的多个区域进行扩增， 该方法不仅具有特异、 快速、敏感、 成本低等优点， 更适用于大量临床样品的检测[5]。 本研究拟建立一种能够同时并同步检测上述 2 种病原体单一或混合感染的 RT-PCR 方法， 以对临床病料进行快速、 准确的诊断。1? ? 材料与方法1.1? ? 病毒、 细胞、 质粒及菌株PRRSV 系贵州省动物疫病研究室鉴定并传代保存 ； SIV 系华南农业大学惠赠 ； mark-145 系中国兽医药品监察所惠赠 ； pMD19-T? ? Vector 购自 大连宝生物公司 ； 大肠杆菌感受态 Top10 由贵州省动物疫病研究室制备和保存。1.2? ? 主要试剂及仪器MEM 培养基、 新生牛血清 (NCS)均系 Hy-Clone 公司 产品 ； 分子质量标准物 DL? 2000? Marker 购自 大连宝生物工程有限公司 ； TaKaRa? MiniBEST?Universal? Genomic? DNA ＆ RNA?Extraction? Kit? Ver.4.0 购 自 大 连 宝生 物 工 程 有 限 公 司 ； E.Z.N.A.TM?Gel? Extraction? Kit(50) 胶 回 收 试 剂 盒系 OMEGA 公司 产品 ； 普通质粒小提试剂盒为 TIANGEN 公司 产品 ； 异丙醇、 无水乙醇等为 国 产分析纯试剂。Icycler? Thermal? cycler 型 PCR 仪 为BIO-RAD 公司产品。1.3? ? 引物设计参照 NCBI 中 PRRSV? ORF6（NC_001961）、 SIV? M（GU086140）等 基 因 序列， 应 用 DNAStar、 Oligo、MPprimer? and? MFE? primer 设计多重PCR 引物， 用于扩增目 的基因片段[6]。引物序列详见表 1。1.4? ? 病毒核酸提取?分别将接毒细胞悬液及临床匀浆样品反复冻融 3 次后， 各取? 200? µ L， 参照 RNA ＆ DNA? 提取试剂盒说明 书，按步骤提取病毒 RNA， 利用蛋白 质核酸仪测定其浓度， -20? ℃保存备用。1.5? ? RT-PCR 反应? ?单 一 RNA 病 毒 RT-PCR 反 应。摘 要： 为建立可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 （PRRSV） 与猪流感病毒 (SIV) 二重 RT-PCR 方法， 研究根据 GenBank 登录的相关病毒基因序列， 选择保守区域设计引物， 经过反应条件的优化， 建立了可同时检测以上 2 种病毒的 RT-PCR 诊断方法， 扩增的目的片段长度分别为 364 bp （PRRSV） 和 981 bp( SIV)。 通过实验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性， 对 PRRSV 和 SIV 的核酸检测最低浓度分别为 3.2×10-3 ng 和 2.7×10-3 ng。 应用该方法对 32 份临床样品进行检测发现， PRRSV 阳性率为 43.8%， SIV 阳性率为 31.3%， 二重感染率为 9.4%。 该方法的成功建立为快速高效地检测以上 2 种病毒提供了有力手段。 关键词 ： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ； 猪流感病毒 ； 二重 RT-PCR? ?基金项目 ： 贵州省科学技术基金项目 资助 (黔科合J字 [201 3]21 1 0 号 )； 贵州省 201 1 年农业攻关项目 资助 [编号： 黔科合 NY 字 （201 1 ）31 03 号 ] ； 贵州省 201 0 年农业科技攻关项目 [ 编号： 黔科合 NY 字 （201 0）3042 号 ]；研农 201 401 3作者简 介 ： 王洪光（1 989-）， 女， 硕士研究生， 主要从事动物传染病病原分子病毒学的科研学习 。* 通讯作者 ： 汤德元（1 964-）， 男 ， 教授， 博士， 硕士生导师， 主要从事动物传染病病原分子生物学和中西兽医结合的教学科研工作。 E-mail: tdyuan@1 63. com表 1 　扩增目的片段的引物病毒目的基因引物序列 (5′-3′)片段大小 /bpPRRSVORF6GGCCGACTGCTAGGGCTTTTTTCTGCCACCCAACACGAGGTTAAAGATGAGCCTTCTGACCGAGG364SIVMAGCGCTATGTTGACAAAATGACC981