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    188宝金博页面版: 环境致癌物真核细胞DNA传感系统初步研讨

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    内容提示： 环境致癌物真核细胞DNA传感系统初步研究幸石丹 张江华 江明 梅素容周宜开吕斌华中科技大学同济医学院环境与健康188宝金博页面版部重点实验室湖北武汉430030摘要：【目的】利用含GADDl53启动子含光素酶(LuC)报道基因的重组人肝二倍体细胞株发光传感系统检测环境致癌物．【方法】将含全长GADDl53启动子的质粒，瞬时转染人肝癌、HepG2细胞，构建pGADDl53．LUC质粒重组HepG2细胞检测体系，与某些环境致癌物作用后以虫萤光素酶发光体系测定其发光值，比较不同种类(如重金属类、二英、苯并(a)芘、环境雌激素类等)和不同浓度环境致癌物对重组细胞系的作用．【结果1总共9类26种环境致癌物...

    文档格式：PDF | 页数：4 | 浏览次数：11 | 上传日期：2019-05-08 01:18:00 | 文档星级：
    环境致癌物真核细胞DNA传感系统初步研究幸石丹 张江华 江明 梅素容周宜开吕斌华中科技大学同济医学院环境与健康188宝金博页面版部重点实验室湖北武汉430030摘要：【目的】利用含GADDl53启动子含光素酶(LuC)报道基因的重组人肝二倍体细胞株发光传感系统检测环境致癌物．【方法】将含全长GADDl53启动子的质粒，瞬时转染人肝癌、HepG2细胞，构建pGADDl53．LUC质粒重组HepG2细胞检测体系，与某些环境致癌物作用后以虫萤光素酶发光体系测定其发光值，比较不同种类(如重金属类、二英、苯并(a)芘、环境雌激素类等)和不同浓度环境致癌物对重组细胞系的作用．【结果1总共9类26种环境致癌物的萤光素酶诱导率的阳性率为92．31％(24／26)。而且均显示了良好的剂量反应关系，同时致癌能力越强的物质，其萤光素酶的诱导率就越高．检测灵敏度高于彗星实验和AMES实验．【结论】带有GADDl53一LUC质粒的重组人肝二倍体细胞株可用于快速、敏感的检测某些类的环境致癌物．关键词：HepG2细胞株重组GADDl53萤光素酶环境致癌物DNA是生物体内的遗传物质，环境致癌物通过直接或间接作用造成的DNA损伤，能引起基因突变和细胞转化并最终发展为肿瘤。生长抑制与DNA损伤基因153(GADDl53)属于(}ADD家族，在DNA损伤因素的诱导下，GADDl53基因mRNA及蛋白水平均快速增加【Ⅻ。本研究利用GADDl53启动子作为诱导基因，虫萤光素酶作为报告基因，构建一株可以快速灵敏检测DNA损伤的真核细胞系，并评价其检测敏感度、遗传毒性检出阈，为筛选环境致癌物提供一种新的方法。1．材料与方法1．1材料pGADDl53--LUC由本实验室构建，；虫萤光素(Pierce公司)；Lipofectamine 2000转染试剂盒，OPTI．MEMI培养基(Invitrogen公司)；BCA试剂盒(Pierce公司)；Lowry’S法蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad公司)；其他试剂均为国产分析纯。1．2方法(1)细胞转染与染毒人肝母细胞瘤细胞株HepG2按转染试剂盒说明书进行转染。转染后的细胞，在新鲜不含胎牛血清的培养基中加入相应浓度的致癌物溶液或按30Jimz紫外线照射30rain，每个浓度做3个平行样，37"C，5％C02饱和湿度下继续培养24h(过氧化氢和顺铂培养时间为lh)后测量。(2)发光检测按荧光素酶测定试剂盒说明检测萤光素酶活性同时测定蛋白浓度。酶活性用RLU／Ixg蛋白表示。各剂量组的发光值与正常对照组的发光值的比值表达萤光素酶的诱导率。(3)单细胞凝胶电泳参照Singh法【3l进行碱性单细胞电泳法(SCGE)。每片观察100个细胞核，单细胞凝胶电泳分析软件(Kineticimage公司，英国)分析结果。计算拖尾率和平均尾长。根据“彗星”尾中DNA含量占DNA总量的百分比将细胞损伤分为0级：<5％，无损伤；A级：5*／,-20％，轻度损伤；B级：>20-40％中度损伤：C级：>40-95％重度损伤：D级：>95％完全损伤。(4)评价指标敏感度(％)=阳性结果的致癌物质／致癌物总数×100％遗传毒性检出阈(IS g／m1)．实验中检‘基金项目：国家自然科学基金资助项目fNO 30200061)400

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