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华肝 畦病 杂~： 2001 2 Jq 第 9 卷 第 6 期C hin J t lepalo1 December 2001，V ol 9，N o． 6 外无其他 不 良反应，拉米夫定亦无明显副 反应。三药物对 肾功能 、血 白细胞数等均 无明显影响，在临床治疗中均较安全。 三 、讨论 拉米夫定具有抗病毒疗效 应少等优点 ，但停药后易复 发 随着疗程 延长易诱发病毒 D NA 聚台酶基 因变异 (Y MDD 变异) 株。我们单用拉米夫定或 与 膦 甲酸钠 、 己肝散联用，H BV DNA 阴 转 H BeAg 阴转 均较明显， 以拉米夫 定 联台磷甲酸钠组阴转率较高。 膦甲酸钠为 、 不良反 非核苷类广谱抗病毒药， 直接作用于核酸 聚台 酶的焦磷醢结台部位 ． 抑制病 毒特异 的 DNA 多 聚酶和 逆转录酶 。膦 甲酸钠疗 程短 ，延长疗程 、加大剂量 是否 能增强其 疗效或协同增强拉术夫定的疗效 、减少 YMDD 变异株 出现 ，有待 于进一 步观察 。 磷 甲酸钠治疗后是否会有耐药病毒株出 现 也需 进步研究 口服 乙肝散安 全性 较好 。 本研 究中 乙 肝散治疗组 HBV DNA 、HBeA g 阴转率 ( 18． 2％) 均较 文献 报道 { 37％、 46． 7％) 明 显低【 川．或 与病例数 相对 较少 等 因素 有 关，需 进一步观察 ， 参考文献 1 中华医学台传染病与寄生虫病分会 学分会修订病毒性肝炎防治方案 中华肝 脏病杂志，20o0，8 324— 329 王宇明．乙肝散治疗已型肝炎的多中心试 验与临床研究中华肝脏病杂志 2000．8 肝病 2 I80 ( 收稿 日期：2001— 08- 08) 校对：李廷坤 ) (本文编辑：何亚玲 顺铂对人肝癌细胞凋亡及相关基因野生型 p53、 p21WAF1 ／ CIP1 和 c— myc表达的影响 刘 登 洋 马力 1．材料与方法：主要试剂：人肝癌 细胞株 SMMC一 7721引自第二军医大学 1 啊铂购 自美 国S igma公 司， 生 物素标记 人 野生型 p53 {w tp53 ) 、p21WAFI／ CIPI 和 C- Rlyc探针为北京中山公司产品，原位杂 交试剂盒购自北京医科大学病理系 细胞 总 RNA 提取试剂盒购 自华美生物工程公 司。方法：(1) 细胞捅亡模型的构建：用 MTT 比色法观察抗癌药顺铂对肝癌细胞 生长的抑制作用并计算抑制率。 收集不同 药物浓度作用下的培养细胞，进行H E 染 色， 倒置 光显微镜下观察细 胞凋亡及坏死 的形态变化并计算捅亡率。 不同作用点的 细胞培养至预定时间， 收集后离心沉淀常 规提取 RNA 、琼脂糖凝胶 电泳 、紫 外灯 下观察并照像。 (2)三种基因在捅亡中的表 达情况：细胞爬片 mR NA 原位杂交：操 作按试剂盒进 行， 操作 中以不加生物 素标 记的裸探针为阴性对照 结果判断： 泉中出现紫褐色颗粒为阳性， 无紫褐色颗 粒者为阴性。 细胞总R NA 提取及northern blot 杂交：选择 50 mol／ L 顺铂作用后 0、1 6 h 和 1 2 h 细胞， 洗涤后离心沉淀， 按试剂盒说明提取总 R NA ，northern 杂 胞 作者单位：221006 袜州二附属医院消化科 ( 刘登洋) ：兰讣 j医学院第 二附属医院消化科 ( 马力) 棘仆 l医学院第 交采取点杂交社。 2 结果 ：MT T 比色试验 提示顺铂对 人肝癌细胞株 SMMC 一 7721 生长有显著 的抑制作用 且抑 制作 用与时 间和药物淮 度之间有明显的时效关系和量效关系。 HE 染色显示经不同浓度顺铂作用后均 出 现典型的凋亡形志学改变且细胞在低浓 度顺铂作用 F 其凋亡指数有时间和浓度 依赖关系，而在高浓度时．则以坏死为 主 。 DNA 电泳示顺铂作用后 12． 24． 48 h 皆见 DNA 梯状 带谱 而未加药者未 出现 梯状带谱，证实凋r=的发生。杂交结果发 现三种基因在凋亡过程中皆有表达， 原位 杂交示 w tp53、 p21wAF1／ CIPI、 C- myc在 顺铂作用0、 1 6、 12 h 阳性率分别为0％、 3％、 16％．4％：8‰、 14％、 17％ 0％、 i)％、 6％． 11‰ 。 norther[1杂交示 wtp53 基 因 的表 达 峰值 出现 在 c — m y c 、 p21WAFI／ CIPI 基因之前．C- my c 基因在 23％； 凋 亡过程 中表达逐渐增 强． 在 wtp53基 因 达 峰值 后则 明显增 强． 而 p21 w P 则在 之 间有严格 的时序性 。 3讨论 基因．是 ‘种重要的抑癌基因，也是细胞 凋亡的 关键基 因， 但 并不是凋亡的必须基 因，然而对 DN A 损伤 而诱导 的凋亡 却是 必不_ Ⅱ J 步的。 奉研究用细胞毒类抗癌药顺 p53基 因选峰值后方始表 达， 两者 wtD53 基 因即野生型 p53 铂 诱导 肝 癌细 胞 凋 亡 ， 原位 杂 交 和 northern 杂交 皆探 涣 I到该 基 因的表 进， 说 明wtp53参与了肝癌细胞的凋亡过程。 c— Illy C基因为细胞增殖的早期反应基因， 其 编 码产 物有 诱 导凋 亡和 促进 增殖 的双 重 作用．但以何种作用为主，各家说法不 一， 有作者认为若细胞同时接受了某些抑 癌基因{ ~gp53基因) 的刺激信号 c- my c 基因则促进细胞发生捅亡． 此点已为本实 验 证实。 研究 中我们还 同时发现 c— myc在 wtp53 表达后明显增强，提示 wtp53 通 过某种机制促进了 c- myc 基因的表达并 对它有上调作用。p21w 细胞周期负向调控基因， 其蛋白产物能广 泛抑制 cy~li ns— cdks 活性，抑 制 DNA 台 成，对 DNA 损伤 因子 的反应 还可 以引起 细胞捅亡。 本实验结果显示该基因在细胞 凋亡中被激活，说明 p21 wAFI／ P 参与 了细胞的捅亡， 研究结果还显示wtp53表 达先于 p21WAF1 ／ CIPI 的表达，两者在时 间顺序上有严格的先后关系， 说明wtp53 对 p21WA F I／ EIPI 基因可能有正调控作 用。 莪们的研究结果认为在顺铂诱导的凋 亡中， p21WAF I／ CI P[的基因表达呈wtp53 依赖性 ．wtp53对 p21基 因在转录 水平上 有上 调作用。 ( 收稿 日期{ 本文编辑何亚玲／ cIP 基因是 2000— 12- 08) 校对：李延坤) 维普资讯 http://www.cqvip.com