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188宝金博页面版: 高效茶树毛状根遗传转化方法

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内容提示: 茶树遗传转化 1、菌株制备(1-4 天): K599 转化: 将表达质粒转入 K599 菌株中,并涂板在含有链霉素(50 mg/L)和卡那霉素(50 mg/L)的 LB 平板上 28℃培养两天。 挑单克。旱ゾ浣又钟诤辛疵顾兀50 mg/L)和卡那霉素(50 mg/L)的 LB 液体培养液(1mL),28℃,200rpm, 过夜。 小摇转大。航 3mL 的菌液转移到 40 mL 含链霉素(50 mg/L)和卡那霉素(50 mg/L)的 LB肉汤中,28℃,200rpm,培养至 OD600 = 0.8 - 1.2。 2、真空渗透(第 5 天): 制备侵染液:离心机室温下 5000 rpm, 离心 10 min 收集细菌,将细菌悬浮于浸渗液(10mM MES, 10 mM MgCl 2 , 200 μM As, pH = 5.2)中,调整浓度为 OD6...

文档格式:DOCX | 页数:2 | 浏览次数:67 | 上传日期:2023-10-10 21:38:57 | 文档星级:
茶树遗传转化 1、菌株制备(1-4 天): K599 转化: 将表达质粒转入 K599 菌株中,并涂板在含有链霉素(50 mg/L)和卡那霉素(50 mg/L)的 LB 平板上 28℃培养两天。 挑单克。旱ゾ浣又钟诤辛疵顾兀50 mg/L)和卡那霉素(50 mg/L)的 LB 液体培养液(1mL),28℃,200rpm, 过夜。 小摇转大。航 3mL 的菌液转移到 40 mL 含链霉素(50 mg/L)和卡那霉素(50 mg/L)的 LB肉汤中,28℃,200rpm,培养至 OD600 = 0.8 - 1.2。 2、真空渗透(第 5 天): 制备侵染液:离心机室温下 5000 rpm, 离心 10 min 收集细菌,将细菌悬浮于浸渗液(10mM MES, 10 mM MgCl 2 , 200 μM As, pH = 5.2)中,调整浓度为 OD600 = 0.8。将浸渗液 放入 20℃培养箱 3-5h。 准备转化外植体:取茶树 2 - 4 节的分枝(0.5 - 1 年生,长~10 cm,直径~0.5 cm),在基部斜切,获得用于遗传转化的分枝外植体。以茶树带叶柄(约 6 个月)的叶片为外植体进行遗传转化。 侵染:将枝叶外植体创面浸泡在浸润液中。将外植体与渗透液一起放入真空罐中,真空 30 min。侵染后的外植体在无菌蛭石中 24±2℃,16 h 光/8 h 暗光周期,高湿度环境中培养。 3、转基因毛状根验证(第 6-60 天): 典型的毛状根形成大约在转化后 35 - 50 天开始。 转基因毛状根可以用通过转化质粒上的标签识别,比如 GFP 通过荧光荧光可视化闪光灯(luyer -3280)识别;GUS 通过 GUS 染色法识别。 遗传转化效率的计算公式如下:(含有阳性根的外植体数量)/(外植体总数)]× 100%。 通过常规 PCR 扩增和共聚焦观察进一步确认 gfp 阳性根。

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