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188宝金博页面版: 脾细胞的获取

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内容提示: 脾细胞的获取 最后一次免疫后 10 天, 处死小鼠 1) 小鼠脱颈臼处死, 在 75%酒精中浸泡 1~2 分钟 2) 剪开左侧腹胸交接部皮肤和肌肉, 暴露脾脏, 用小镊子将脾镊起, 剪下, 除去非脾组织,在无血清培养基中洗一下。 置于 200 目筛网上, 筛网置于盛在 12ml 无血清 RPMI-1640的 6ml 平皿上。 3) 用注射器研磨脾脏, 使细胞通过筛网, 落于平皿中的培养基中。 4) 将细胞悬液转入无菌离心管中, 1000-2000rpm, 3’ , 室温。 5) 弃上清, 打散细胞后加入 5ml 红细胞裂解液, 室温放置 6’ 6) 加 5ml PBS,离心, 弃上清, 打散细胞。 7) 用 7 ml 无血清培养基洗一次, 再用 7 ml 有血...

文档格式:DOC | 页数:1 | 浏览次数:153 | 上传日期:2015-07-05 05:43:26 | 文档星级:
脾细胞的获取 最后一次免疫后 10 天, 处死小鼠 1) 小鼠脱颈臼处死, 在 75%酒精中浸泡 1~2 分钟 2) 剪开左侧腹胸交接部皮肤和肌肉, 暴露脾脏, 用小镊子将脾镊起, 剪下, 除去非脾组织,在无血清培养基中洗一下。 置于 200 目筛网上, 筛网置于盛在 12ml 无血清 RPMI-1640的 6ml 平皿上。 3) 用注射器研磨脾脏, 使细胞通过筛网, 落于平皿中的培养基中。 4) 将细胞悬液转入无菌离心管中, 1000-2000rpm, 3’ , 室温。 5) 弃上清, 打散细胞后加入 5ml 红细胞裂解液, 室温放置 6’ 6) 加 5ml PBS,离心, 弃上清, 打散细胞。 7) 用 7 ml 无血清培养基洗一次, 再用 7 ml 有血清培养基洗一次 8) 将细胞体积调至 5ml , 稀释 100 倍计数, 调成 2*106/ml, 接种于 24 孔板。 每种细胞分别接终于 3 个孔中, 第一个孔 1ml, 用于细胞计数, 第二个孔 1ml,用于第二天加多肽, 第三个孔 0.5ml, 用于第二天加入 ELISPOT 中。 9) 剩余的细胞, 每种分成两管冻存。 细胞的冻存: 介于 DMSO 对细胞有刺激和伤害作用, 故为提高冻存细胞的存活率, 在细胞冻存过程中应注意两个原则: 1。 添加 DMSO 时应有少到多, 由慢到快, 使细胞周围的 DMSO 缓慢增加, 2。 冻存液以及冻存管应冰水预冷。 自配的细胞冻存液: 溶液Ⅰ : 10mlDMSO 40ml 含 10%FCS 的 RPMI-1640 培养基 溶液Ⅱ: 26ml FCS 24ml RPMI-1640 培养基 用法: 1. 离心细胞, 弃上清。 2. 取 1ml 溶液Ⅰ , 重悬细胞。 3. 取 1ml 溶液Ⅱ, 缓慢滴入滴入前一步的溶液Ⅰ 中, 边滴边混匀。 4. 分装入两个冻存管中, 现在-80℃放置过夜, 再转入液氮保存。

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