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    188宝金博页面版: [精品]RT-PCR实验心得

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    内容提示： http: //www.invitrogen.com /site/us/en/hom e/Global/m olecular-biology-cell-biology-applications.htm l RT-PCR 实验心得 ■ 提取 RNA(我做细胞的) 1.取中号培养瓶(100ml 培养瓶 注:此时细胞汇合度≥80%),用 PBS 洗细胞两次，弃尽 PBS 后加 2mlTRIzol（量大无防！ ） , 细胞用用吹打管吹至液体澄清且无细胞团块转至 2 个 1.5EP 管中. 2.颠倒摇晃 10 下， 室温 5 分钟. 3.在 2 个 EP 管中各加入 0.2 ml 氯仿。 盖紧样品管盖， 用手用力摇晃试管 15 秒并将其在 30°C 下孵育 2—3 分钟。 4.在 2—8°C 下用不超过 12,000×g 的离心力高速冷冻离心 15 分钟...

    文档格式：DOC | 页数：6 | 浏览次数：64 | 上传日期：2015-03-27 03:08:40 | 文档星级：
    http: //www.invitrogen.com /site/us/en/hom e/Global/m olecular-biology-cell-biology-applications.htm l RT-PCR 实验心得 ■ 提取 RNA(我做细胞的) 1.取中号培养瓶(100ml 培养瓶 注:此时细胞汇合度≥80%),用 PBS 洗细胞两次，弃尽 PBS 后加 2mlTRIzol（量大无防！ ） , 细胞用用吹打管吹至液体澄清且无细胞团块转至 2 个 1.5EP 管中. 2.颠倒摇晃 10 下， 室温 5 分钟. 3.在 2 个 EP 管中各加入 0.2 ml 氯仿。 盖紧样品管盖， 用手用力摇晃试管 15 秒并将其在 30°C 下孵育 2—3 分钟。 4.在 2—8°C 下用不超过 12,000×g 的离心力高速冷冻离心 15 分钟。 离心后混合物分成三层： 下层红色的苯酚-氯仿层， 中间层， 上层无色的水样层。 5.用移液枪分别转上层水相（约 500-600μl） 于另二个 1.5mlEP 管中,加等体积异丙醇（约 500-600μl） ， 混匀室温 10 分钟来沉淀 RNA→在 2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心 10 分钟。 注:移液枪的枪头不宜伸入液面太深,以防洗上中层液体!;离心前注意放管的方向,此时RNA沉淀形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。 6. 舍弃上清,用 75%的乙醇(用 DEPC 水处理的,临时十分钟配,预冷保存于 4°C 或-20°C) 1 ml 来洗涤 RNA 沉淀→在 2—8°C 下以不超过 7,500×g 的离心力高速冷冻离心 5 分钟。 ;离心前注意放管的方向, 注:旋涡振荡混合样品;RNA 在 75%乙醇中， 2-8℃至少可保存一周， -20℃至少可保存一年! 75%乙醇（要在抽提时现配） ： 用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3） ，然后放于-20℃备用。 7 弃上清， 置于卫生纸上， 自然晾干（不能完全干燥） ,用 20-50μl DEPC 水溶解。(建议装于 0.6 的 EP 管中.) 8 紫外光度检测 注:该步后,可保存于-70℃超低温冰箱, 或算好计量建立体系立即用 于逆转录. ■ RT 反应体系注意事项 1. RT 试剂盒中试剂解冻后, 摇晃试管使其均匀,在稍离心,放于冰盒上.反应也在冰上操作. 2 PCR 仪预热到 50°C,在放 PCR 管于 PCR 仪上(之前在冰上!)开始逆转录. 3 反应体系准备: 比原体系大 10%; 建立 25ul 的反应体系; 先按总反应体系混合总体体系反应物, 在分装于 PCR 管中(分装前宜离心! ) , 再分别加 RNA 和引物/内参; 4 RNA 的量宜大 2ug/reaction! 5 要有要有逆转录(50℃, 30min)和初始热活化(95℃, 15 min); ■Reaction components for one-step RT-PCR using Q-Solution（188宝金博页面版一步法） Component Volume/reaction Master mix Final concentration

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