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７ ２Ｈ ｅｉｌｏ ｎ ｇ ｊｉａ ｎ ｇＡ ｎ ｉｍ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉｅ ｎ ｃ ｅａ ｎ ｄＶ ｅ ｔｅ ｒ ｉｎ ａ ｒ ｙＭ ｅ ｄ ｉｃ ｉｎ ｅＮ ｏ ４２ ０ ０ ８鸭源黉肠球菌细胞壁蛋白的Ｓ Ｄ Ｓ —Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 分忻韩梅红１， 谷长勤２（ １． 长江大学动物科学学院， 湖北荆州４ ３４ ０ ２５； ２． 华中农业大学动物医学院， 湖北武汉４ ３０ ０ ７ ０ ）中图分类号： ￥ ８ ５２． ６１＋ １文献标识码： Ｂ文章编号： １０ ０ ４ —７ ０ ３４ （ ２０ ０ ８ ）０ ４ － ０ ０ ７ ２—０ ２禽类的肠球菌病是由各种肠球菌感染引起的禽类的一种急性或慢性传染病。 本研究采用Ｓ Ｄ Ｓ —Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 技术分析４ 株鸭源粪肠球菌临床分离株和１株粪肠球菌参考菌株的细胞壁蛋白， 比较各菌株细胞壁蛋白的异同， 旨在揭示同种不同株粪肠球菌的细胞壁蛋白有何共性， 以及它们之间存在的差异。 这不仅为禽类肠球菌病的病原学研究提供理论依据， 而且为该病的流行病学调查、 快速检测技术以及免疫预防等方面的临床研究提供十分重要的参考资料。１材料与方法１． １菌株和主要试剂鸭源粪肠球菌临床分离株郑１株、 郑２株、 郑３株和北京株共４ 株， 由湖北省农科院畜牧兽医研究所提供， 分离于自然感染发病濒死期和已死亡鸭的肝脏、 心血和脑组织液； 参考菌株１９ ２７ （ Ｃ ５５６ １４ ）粪肠球菌， 购自中国兽医药品监察所； 胰蛋白胨（ Ｔ ｒｙ ｐ ｔｏ ｎ ｅ），Ｏ Ｘ Ｏ ＩＤ 产品， 批号为３２４ ０ ７ ５； 聚乙二醇８ ０ ０ ０ （ Ｐ Ｅ Ｇ８ ０ ０ ０ ）， Ｆ ｌｕ ｋ ａ 分装； 蔗糖， Ａ ｍ ｒ ｅｓｃｏ 公司产品； 蛋白质Ｍ ａ ｒｋ ｅｒ， 批号为０ ９ ０ １， Ｆ ｅｒｍ ｅｎ ｔａ ｓ公司产品； 丙烯酰胺，购自原平皓生物技术公司； Ｔ Ｅ Ｍ Ｅ Ｄ 、 Ａ Ｐ Ｓ ， 购自华美生物工程公司； Ｓ Ｄ Ｓ 、 ％ｓ Ｂ ａ ｓｅ、 甘氨酸， 均购自Ａ ｍ ｒｅｓｃｏ公司。１． ２培养基Ｔ Ｈ Ｂ 培养基： 牛肉浸膏ｌｏ ． ０ ０ｇ ， 胰蛋白胨２０ ． ０ ０ｇ ， 葡萄糖２． ００ｇ ， Ｎ ａ Ｈ Ｃ ０ ３ ２ ． ０ ０ ｇ ， Ｎ ａ Ｃ Ｉ２． ０ ０ｇ ，Ｎ ａ ２ Ｈ Ｐ ０ ４ ０ ． ４ ０ｇ ， 纯化水１０ ０ ０ｍ Ｌ ， 调ｐ Ｈ 值为７ ． ８０ ． ２， １１５ｏ Ｃ 灭菌３０ ｍ ｉｎ ； 加５％脱纤绵羊血和１． ５％４ －琼脂粉即得Ｔ Ｈ Ｂ 血琼脂培养基。１． ３细菌的鉴定（ 另文发表）１． ４ 细胞壁蛋白的制备按《分子克隆实验指南》 中的方法…稍加改动，主要步骤： 供试菌株分别接种于１０ ０ ｍ Ｌ Ｔ Ｈ Ｂ 液体培养基中， ３７ ℃恒温培养１８ ｈ ， ３０ ０ ０ｇ 、 ４ ℃离心３０ｍ ｉｎ收集菌体； 沉淀用３０ｍ ｍ ｏ ｌ／Ｌ 灭菌％ｓ（ ｐ Ｈ 值８． ０）洗细胞３次， 离心（ 离心速度、 时间同上）； 将沉淀均收稿日期： ２０ ０ ７ —０ ６—０ ２； 修回日期： ２０ ０ ７ 一０ ７ 一０ ７作者简介： 韩梅红【１９７ ９一）， 女， 助教， 硕士．匀悬浮于１０ ｍ Ｌ 含８ ０ｍ ｇ ／ｍ Ｌ 溶菌酶的细胞悬浮液（ 含３０ｍ ｍ ｏ ｌ／ＬＴ ｒｉｓ， ３ ｍ ｍ ｏ ｌ／ＬＭ ｇ Ｃ ｌ２和２５％蔗糖）中， ３７ ｃｃ孵育１． ５ ｈ ； 超声波粉碎菌体细胞（ 设置工作时间２０ ｓ， 间歇时间３０ ｓ， 总时间８ —１０ ｍ ｉｎ ， 功率１８ ０ｗ ）； 将裂解物先１ ０ ０ ０ｇ 、 ４ ℃离心１０ｍ ｉｎ ， 弃沉淀（ 未裂解的完整细胞）； 取上清液于６０ ０ ０ｇ ，４ ｑ Ｃ 离心２０ ｍ ｉｎ ， 取沉淀即为细胞壁制备物。 该细胞壁制备物再经７ ０ ％饱和硫酸铵沉淀蛋白质， 此沉淀用Ｐ Ｂ Ｓ４ ℃透析溶解， Ｐ Ｅ Ｇ８ ０ ０ ０ 浓缩至适当浓度， 加入蛋白酶抑制剂Ａ ｐ ｒ ｏ ｔｉｎ ｉｎ （ 有效浓度２ ｐ ． ｇ ／ｍ Ｌ ）， 用于Ｓ Ｄ Ｓ —Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳和Ｗ ｅｓｔｅｒ ｎ —ｂ ｌｏ ｔ分析。１． ５Ｓ Ｄ Ｓ —Ｐ Ａ Ｇ Ｅ１． ５． １Ｓ Ｄ Ｓ 一聚丙烯酰胺凝胶的制备夹好灌制聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板， 并用配套的橡皮条将玻璃板边缘密封， 防止漏胶； 戴上手套， 配制１２％的Ｓ Ｄ Ｓ 一丙烯酰胺（ 参考《分子克隆实验指南》 中的方法…配制）约７ ｍ Ｌ ； 用加样器迅速将制好的分离胶匀速注入两玻板的间隙中， 留出灌注积层胶所需空间４ ｍ Ｌ 左右， 在分离胶上层加入一层水饱和的异丁醇以便与空气隔离， 室温放置约４ ５ ｍ ｉｎ ； 丙烯酰胺完全聚合后倾出覆盖层液体， 用ｄ ｄ Ｈ ： Ｏ 淋洗凝胶顶部数次以便除去异丁醇和未聚合的胶， 然后用纸巾吸净残留液体；配制５％积层胶（ 参考《分子克隆实验指南》 中的方法…配制）４ ｍ Ｌ ， 立即灌入分离胶上层， 立即插入梳子， 室温放置。１． ５． ２电泳待胶全部聚合后移出梳子及橡皮条，用水洗去加样槽中未凝聚的丙烯酰胺， 用针头将加样槽的齿拨直； 将灌制好聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板固定于电泳装置上， 加入１× Ｔ ｒ ｉｓ一甘氨酸电泳缓冲液；５个菌株的抗原样品分别与样品缓冲液１： １混合后， 置１０ ０ ｏ Ｃ 水。保埃 ｉｎ ， 冷却； 取此混合物１５此加入样品槽中并覆以电泳缓冲液， 其中， 第１孑Ｌ 加入分子质量为１０ ～２０ ０ ｋ ｕ 的１３个标准蛋白质混合物作为分子质量定型标准， ２—６ 孔分别加入不同菌株的蛋白样品； 接通电源并将电压调至８ ０ Ｖ ， 待溴酚兰进入到分离胶后， 将电压升高至１２０ Ｖ ， 待溴酚兰跑到分离胶底部时关掉电源， 需时约２ ｈ 。１． ５． ３染色取出聚丙烯酰胺凝胶， 用自来水清洗　　万方数据