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HeiIongjiang AnimaI Science and Veterinary Medicine黑龙江畜牧兽医 2004 年第 2 期收稿日期：2003 - 10 - 14作者简介：鄢志强 （1976 - ） ，男，江西高安人，硕士研究生.鸭疫里氏杆菌保存条件探讨鄢志强1，颜晓芸2，潘金谷3， 王林川1（1. 华南农业大学 兽医学院禽病研究室，广东 广州 510640 ；2. 江西省东乡县畜牧水产局，江西 东乡 331800；3. 江西海博动物保健技术服务中心，江西 南昌 330001）中图分类号：S858. 32文献标识码：B文章编号：1004 - 7034 （2004） 02 - 0038 - 01 鸭疫里氏杆菌 （ Riemerella anatipestifer，简称 RA） 感染，又称为鸭疫传染性浆膜炎 （ Infectious serostis of duck） ，曾命名为鸭疫巴氏杆菌。洳”涮卣魑宋匦孕陌、 肝周炎、 气囊炎及脑膜充血、出血，主要感染 1 ~ 8 周龄雏鸭，2 ~ 3 周龄雏鸭最易感染，死亡率差异较大［1］。 RA 对各品种的鸭都有致病性，对鹅、鸡及其他水禽也具有致病性，发病率和死亡率都很高，已成为：ρ家底钪匾南妇圆≡。 研究和实践证明，鸭疫里氏杆菌的 血清型较多 ， 到 目 前为 止， 共有 21 个 血清 型 （1 ~21 型） ，各血清型之间又不能交叉保护， 使得针对鸭疫里氏杆菌的疫苗免疫更为复杂［2］。 因此， 对整个区域血清型菌株进行收集、保存和监测，对研制富有针对性的疫苗显得十分必要。目 前鸭疫里氏杆菌的保存方法很多， 如血液琼脂斜面、 甘油生理盐水、奶粉冻干以及高福等［3］和吕 殿红［4］等报道的利用带菌鸭血冻结等，但是对各种保存方法的比较研究在国内还没有报道，试验就鸭疫里氏杆菌保存的各种方法进行比较， 现将结果报道如下。1 材料与方法1. 1 材料 菌株均保存在华南农业大学禽病室菌种库，菌株 1 源于广东三水，菌株 2 源于广东南海；试管、培养皿、西林瓶各若干，高压消毒；血液琼脂平面、 血液琼脂斜面培养基以及甘油生理盐水按常规方法配制，高压灭菌；灭菌石蜡油若干。1. 2 方法1. 2. 1 纯化培养 取菌株 1，2 分别接种在血液琼脂平板培养基上，置于烛缸中厌氧培养 24 h，取得纯培养物。1. 2. 2 扩增培养 将菌株 1，2 的纯培养物分别在多块血液琼脂平板上划线，于烛缸中厌氧培养 24 h。1. 2. 3 分装培养 分别将菌株 1，2 的纯培养物划线接种在多个 （ 240） 血液斜面培养基上， 在烛缸中厌氧培养 24 h。 然后划线接种在血液琼脂平板上扩增培养。 扩增培养的细菌用甘油生理盐水洗下 （ 每个培养皿的培养物用 10 mL 甘油生理盐水洗，分别装入 5 个西林瓶） ，每个菌株分装 25 个西林瓶。1. 2. 4 保存 将分装后的 50 个西林瓶培养物置于 - 20C 条件下冻结保存。 通过血液琼脂斜面培养基所得的斜面培养物，分别在20 支中倒入灭菌石蜡油，其中 10 支放入4C 冰箱保存，10 支常温保存； 另 20 支没有加石蜡油的血液琼脂斜面培养物，10 支放入 4C 冰箱保存，10 支常温保存，并记录保存时间。1. 2. 5 观察 每周从每种保存方法保存的培养物中取出 1 支（ 瓶） 接种于血液琼脂培养基，于 37C 烛缸中厌氧培养 24 h，观察细菌的生长情况， 并做记录。 一旦发现失活的菌种， 就把通过此种方法保存的所有剩余的菌株都做培养检验，直到所有的通过此种方法保存的菌种都失活。1. 2. 6 甘油生理盐水法的保存效果 将菌种库中用甘油生理盐水冰冻保存的 6 株鸭疫里氏杆菌菌种接种于血液琼脂平板，37C 烛缸中厌氧培养 24 h。 结果表明，甘油生理盐水保存时间长，但效果也不是很稳定 （ 见表 1） ， 有必要进一步进行确定甘油生理盐水的保存效果。表 1 菌种库中鸭疫里氏杆菌培养情况菌株来源是否存活保存时间 /d南海!+195南海"+120三水+385清远-207肇庆+404广州-3202 结果广东三水和南海株在常温斜面保存 8 d 后均开始出现失活，15 d 后 2 个菌株的常温保存培养物全部失活。 冰箱 （4C ）斜面上保存的培养物中，三水株在 22 d 后开始出现失活， 29 d后所有的培养物都失活；南海株在 29 d 开始出现失活， 36 d 后剩余的菌株都失活。 石蜡常温斜面保存的培养物中，三水株保存到 71 d 仍有存活，但菌落生长较稀疏，南海株在 71 d 后也开始失活；石蜡 （4C ） 斜面保存的培养物中， 三水菌株和南海菌株都是保存到 71 d 开始失活。 三水和南海株在甘油生理盐水中 （ -20C ） 保存 71 d 后仍全部存活，且生长旺盛。 结果表明，常温血液琼脂斜面、4C 血液琼脂斜面、常温石蜡油血液琼脂斜面、4C 石蜡油血液琼脂斜面 4 种方法简便易行， 适用于短期、中期保存。 通过对菌种库中的几株细菌培养表明，甘油生理盐水冰冻保存则适合长期保存，但效果有待进一步验证。3 小结试验结果表明， 试验中使用的 5 种保存鸭疫里氏杆菌方法，对鸭疫里氏杆菌的保存时间和存活率影响各有不同。 通过此试验研究，可以让研究人员针对自 身的研究需要有选择的选用最方便、最安全的保存方法。参考文献：［1］ 蔡玉祥. 家畜传染病学 ［ M］ . 北京： 中国农业出版社，1997.［2］ Sandhu T S. Immunization of White Pekin duckings against PsteureIIaanatipestifer Infection ［ J］ . Avian Diseases，1979，23：662 - 669.［3］ 高福，郭玉璞，张应国. 小鸭传染性浆膜炎疫苗的研究 II. 鸭疫巴氏杆菌矿物油佐剂灭活苗 ［J］. 中国兽医杂志，1990，16 （3） ：46 -48.［4］ 吕殿红 . 鸭疫里默氏杆菌菌种保存试验及蜂胶苗的保护试验 ［ J］ .动物医学进展，2002， （1） ：80 - 81.（009）83