188宝金博页面版

青海畜牧兽医杂志102014年第44卷第5期( 总第233期)鼠疫耶尔森菌疫苗株荚膜抗原的纯化’王梅，张爱萍，于守鸿，赵忠智，谢辉，李君，冯建萍，杨永海，郑谊，唐新元(青海省地方病预防控制所，西宁，811602)摘要：利用AKTApuri fi er 100纯化系统纯化盐析法制备的粗制鼠疫荚膜抗原，并将纯化洗脱的蛋白进行透析、浓缩后采用U l trm pecTM8000紫外光／可见光分光光度计测定其纯度、蛋白浓度和RIBA试验和胶体金纸色谱法对其主要成份的鉴定。结果发现，粗制鼠疫荚膜抗原经过蛋白纯化仪SuperdexTM 凝胶层析柱获得主要组份是种小分子蛋白，其纯度为88．5％，蛋白浓度为1．594 m s／m L，而且RIH A试验证实此蛋白是鼠疫菌F1抗原。关键词：鼠疫耶尔森菌；荚膜抗原；纯化；FI抗原中图分类号：$852．4+3文献标识码：A文章编号：1003-7950( 2014) 05-0010-03Puri fi cati on ofcapsul ar anti genof vacci ne Yersi ni apeses strai nW AN GM ei(Control andpreventi oni nsti tute of endem i c di sease ofQ i nghai -Xi ni ng-811602．)Abstract：Capsul ar anti genW as extracted andpuri fi edfrom sal t fm cti onati on of vacci ne Yersi ni apesti sstrai n w i ththe AKTApuri fi er100bi ol ogi calm acrom ol ecul epuri fi ed system ．Its puri 移W as di al yzed、concentrated、m easured protei npuri ty、i tsconcentrati on through U l trospecTM8000hem aggl uti nati on assay( RIH A) ．-11l eresul ts show ed that the unshaped capsul ar anti gen puri fi edw i th thepuri fi edsystemregai nsral ．Apphcafi onof the RI H Atechnol ogyof Yem i ni apesfi sconfi rm ed that thepuri fi ed protei nW as F1anti gen．Key w ords：Yersi ni apesti s；Capsul ar anti gen；Puri ty；F1 anti genet alU v／vi si bl espectrophotom eterand i denti fi edbyreverse i ndi recta ki nd of sm al l m ol ecul arprotei n．Its puri tyexceeds 88．5％-i ts protei nconcentrati on W as 1．594m g／人类历史上曾发生过三次毁灭性的鼠疫大流行，即为鼠疫耶尔森氏菌( 以下简称鼠疫菌) 。鼠疫菌在37℃产生一种凝胶样的荚膜封套抗原，这种荚膜抗原本身无毒，却是一种抗鼠疫感染的重要抗原¨ ’ 。鼠疫菌荚膜抗原的分离已有报道，包括鼠疫菌扩大培养后，收集细菌用以丙酮沉淀法自菌体中提取而得到的粗制的荚膜抗原，荚膜抗原系多糖蛋白质复合物，抗原成分及结构比较复杂。用2％氯化钠自鼠疫菌粉粗提的荚膜物质，含有32％的蛋白质、2％的糖和一定量的核酸，在37℃干酪素水解培养基上生长的鼠疫菌有28条沉淀带，在7％聚丙烯酰胺凝胶电泳图含有18—25条可见的蛋白带心。4】。本研究得到了一种新的以粗制鼠疫荚膜抗原为原料在AKTA puri fi er蛋白纯化仪SuperdexTM 凝胶过滤纯化的方法，根据分子大小分离蛋白质混合物，并浓缩洗脱蛋白后经U hrospec删8000紫外光／可见光分光光度计测定蛋白浓度，现将结果报道如下。l 材料与方法1．1样品丙酮沉淀法提取而得到的粗制的鼠疫菌疫苗株荚膜抗原由青海省地方病预防控制所鼠疫预防控制科实验室提供。1．2仪器及材料0．45pan薄膜滤菌器，注射器，500m L带盖容量瓶，AKTA puri fi er蛋白纯化仪、U l trospecTM 8000紫外彤可见光分光光度计、SuperdexTM200凝胶层析柱( G E Heal thcare)，胶体金试剂盒( 北京庄迪浩生物技术有限公司) 、鼠疫反相间接血凝试剂盒( 青海省地方病预防控制所) 。1．3试剂甘氨酸，N saItP04．12H 20，N aH 2P04．2H 20，N aCl 、H cl 、乙醇、聚乙二醇20( 0) 0收稿日期：2014-07．12· 基金项目：卫生公益性行业科研专项( 201202021)唐新元：通信作者：Em ai l ：tang19790624@ 126．com1．4方法1．4．1鼠疫荚膜抗原的纯化1．4．1．1准备工作流动相和样品，并对AKTA puri fi er蛋白纯化仪管道及仪器的进行清洗。1．4．1．2按照层析柱要求安装好柱子，再用pH 7．0，20m M PBS( 含150m MN aCl ) 缓冲液平衡柱子，准备用样品环进样。上样后用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线后进行洗脱，并在280nm 跟踪检测蛋白，收集峰的洗脱液，保存纯化洗脱监控结果。1．4．1．3清洗纯化系统及管路，将层析柱保存到20％乙醇中再卸载，并关闭AKTA纯化仪。1．4．2鼠疫荚膜抗原的透析与浓缩因B、C峰蛋白收集的量少，故二者蛋白合并与收集的A蛋白分别装入透析袋，扎紧，用蒸馏水搅拌透析16～20h后，将蛋白包埋于聚乙二醇( PEG20000) ，30rai n后，吸出蛋白溶液，存放于4℃。1．4．3测定纯化鼠疫荚膜抗原的蛋白含量1．4．3．1光度计，在280nm 和260nm 波长分别测定纯化、收集蛋白的Absorbance(吸光度)、％Transrrdssi on(透光率百分比)。1．4．3．2选择W arburg公式相应的计算方法，将吸光值转换为样品蛋白浓度。1．4．4鼠疫荚膜抗原的鉴定试验用鼠疫荚膜抗原做待测样品，进行反向间接血凝试验( RIH A) ，其操作及结果判定均参照《鼠疫诊断标准》( W S279—2008) 中规范性附录E进行uJ 。2结果使用Ul trospccTM8000紫外彤可见光分光万方数据