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    188宝金博页面版: Akt1基因重组慢病毒载体感染体外培养大鼠乳鼠心肌细胞的研究

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    内容提示： 2008江苏省心血管病学学术会议· 大会交流致。2．pXZ208一Akt! 表达质粒酶切鉴定结果：将连接产物pXZ208一Aktl 表达质粒限制性内切酶Bam H I和EcoRI进行370C孵育2h酶切鉴定，经0．8％琼脂糖凝胶电泳分离得到预期的7720bp和2251bp的片断，证明连接产物酶切片断大小正确。3．pXZl 71鉴定结果：使用Xho l 和Bam HI酶切载体pXZl 71，经0．8％琼脂糖凝胶电泳分离得到预期的1376bp和7863bp片断，证明酶切片断大小正确。4．病毒的收获及滴度的检测293T细胞生长至80一90％时，经过脂质体Li pofectam i ne2000介导的慢病毒包装系统，包括pXZ208一Aktl 、pXZl 71表达质粒，共转染293T细胞，转染24h开...

    文档格式：PDF | 页数：2 | 浏览次数：55 | 上传日期：2015-01-05 10:27:58 | 文档星级：
    2008江苏省心血管病学学术会议· 大会交流致。2．pXZ208一Akt! 表达质粒酶切鉴定结果：将连接产物pXZ208一Aktl 表达质粒限制性内切酶Bam H I和EcoRI进行370C孵育2h酶切鉴定，经0．8％琼脂糖凝胶电泳分离得到预期的7720bp和2251bp的片断，证明连接产物酶切片断大小正确。3．pXZl 71鉴定结果：使用Xho l 和Bam HI酶切载体pXZl 71，经0．8％琼脂糖凝胶电泳分离得到预期的1376bp和7863bp片断，证明酶切片断大小正确。4．病毒的收获及滴度的检测293T细胞生长至80一90％时，经过脂质体Li pofectam i ne2000介导的慢病毒包装系统，包括pXZ208一Aktl 、pXZl 71表达质粒，共转染293T细胞，转染24h开始出现荧光，转染后36h，细胞开始融合，代表细胞开始合成VSVG(融合蛋白)，并有大量病毒分泌至上清中，分别收集48h、72h病毒上清。经离心过滤，去除细胞碎片，收获病毒液储存。细胞在第5天后大部分开始细胞脱落。计算病毒滴度，公式为：病毒滴度=( GFP阳性细胞个数× 稀释倍数) ／Il l l 。测定携带AKTI的病毒滴度为6．25× 105IU／m l ，携带GFP的病毒滴度为l × 106IU／m l ，同时使用流式检测荧光细胞含量，AKTI组荧光细胞所占比例为89．94％。5．M SCs的原代、传代培养：在分离培养48h后通过全量换液除去各种类型悬浮生长的血细胞，贴壁生长的原代M SCs数量少，散在存在，呈细而小长梭形，随着M SCs的迅速增殖，3天后出现较大的集落，呈单个分散存在，培养至14天细胞集落扩大，其形态呈较均一的长梭形，以集落方式增殖，达80％一90％汇合时消化传代，每瓶单层汇合M SCs，用胰蛋白酶消化后平均获得5．5× 105个M SCs，将这些细胞再传代培养，～周左右汇合，可继续传代增，随着传代次数的增加。扩增速度也随之增加，平均每2—3天细胞达70％一80％汇合，及时传代，传代细胞生长旺盛呈漩涡样细胞生长融合以后指纹样螺旋生长的现象非常典型。6．免疫组化鉴定hM SCs，几乎所有细胞表面抗原CD29、CD44阳性，这是hM SCs的较特异标志。7．慢病毒以6．25× 10 5滴度感染hM SCs( M O I=2) ，细胞在48h开始出现荧光表达，随着时间延长表达荧光的细胞数量及荧光强度都明显增强，M O I=2的情况下感染hM SC8，细胞很少死亡。将细胞消化吹散使用流式细胞仪分析荧光表达效率为83．57％。W estern bl ot检测病毒感染的hM —SO s的AKTI蛋白表达明显比无病毒感染组高。结论携带Aktl 慢病毒转移质粒构建成功，成功包装携带Aktl 基因的慢病毒。该病毒能高效感染hM sCs，合成AKTI蛋白。Aktl 基因重组慢病毒载体感染体外培养大鼠乳鼠心肌细胞的研究李东野罗园媛夏勇张卓琦朱红潘德峰杨煜徐通达徐州医学院附属医院心内科( 221002)目的目前，缺血性心脏病的临床治疗主要包括药物治疗、介入治疗和外科手术治疗。但是．药物治疗有一定的局限性，血管再通治疗术后易发生再狭窄，且缺乏理想的解决办法。研究已发现梗死后凋亡心肌细胞主要分布在心肌梗死区边缘，对心肌细胞凋亡进行干预以减少心肌细胞丢失为缺血性心脏病的治疗提供了新的途径。近年来，随着基因重组技术的发展。一种从分子水平治疗缺血性心脏病的新方法即基因治疗逐渐受到了人们的重视。本研究改良传统心肌细胞培养方法，然后慢病毒为载体，将抗凋亡基因Aktl 整合整合如大鼠乳鼠心肌细胞，稳定表达抗凋亡蛋白· 16l ·

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