免疫学杂志第２ ４ 卷第１期２ ０ ０ ８ 年１月Ｉ Ｍ Ｍ Ｕ Ｎ Ｏ Ｌ Ｏ Ｇ Ｉ Ｃ Ａ ＬＪＯ Ｕ Ｒ Ｎ Ａ ＬＶ ０ １． ２ ４ Ｎ ｏ ． １ Ｊａ ｎ ． ２０ ０ ８?９ ?Ｆ Ｓ Ｈ － ｏ ｃｃｌｕ ｄ ｉｎ 融合蛋白在毕赤酵母中的表达纯化及免疫原性检测向延芳， 何畏。 ， 袁吉钊， 梁志清， 史常旭（ 第三军医大学西南医院妇产科， 重庆４０００３８）［ 摘要】 目的纯化Ｆ Ｓ Ｈ ． ｏ ｅｃｌｕ ｄ ｉｎ 融合蛋白， 并检测其免疫原性。 方法将表达Ｆ Ｓ Ｈ － ｏ ｃｃｌｕ ｄ ｉｎ 蛋白的酵母工程菌Ｇ Ｓ ｌｌ５／ｐ Ｐ ＩＣ ９ Ｋ 接种到Ｙ Ｐ Ｄ 培养基中多次传代后， 用Ｐ Ｅ Ｒ 检测其目的基因。 该酵母工程菌在Ｂ Ｍ Ｍ Ｙ 培养基中经甲醇诱导表达， 上清液初步浓缩后上柱进行凝胶过滤层析， 并将纯化蛋白免疫Ｂ ａ ｌｂ ／ｃ小鼠， 检测其血清抗体水平， 以免疫组化的方法分析各组织Ｏ Ｃ ．ｃｈ ｄ ｉｎ 的表达与定位。 结果该酵母工程菌经多次传代后外源基因不丢失， Ｗ ｅｓｔｅｒ ｎｂ ｌｏ ｔ检测结果表明纯化蛋白具有很好的反应原性， 免疫组化证实ｏ ｃｃｈ ｄ ｉｎ 在实验组高表达。 结论表达Ｆ Ｓ Ｈ － ｏ ｅｅｈ ｄ ｉｎ 蛋白的酵母工程菌具有很好的遗传稳定性， 其表达产物可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。［ 关键词］Ｆ Ｓ Ｈ － ｏ ｃｃｈ ｄ ｉｎ ； 毕赤酵母； 纯化； 免疫原性［ 中图分类号］Ｒ １６９ ． ４ １； Ｒ ３９ ２． １１［ 文献标识码］ＡＰ ｕ ｒ ｉｆ ｉｃａ ｔｉｏ ｎｏ ｆＦ Ｓ Ｈ － ｏ ｃ ｃ ｌｕ ｄ ｉｎｐ ｒ ｏ ｔｅ ｉｎｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓｓｅ ｄｉｎＰ ｉｃｈ ｉａｐ ａ ｓｔｏ ｒ ｉｓａ ｎ ｄａ ｎ ａ ｌｙ ｓｉｓｏ ｆｉｔｓｉｍ ｍ ｕ ｎ ｏ ｇ ｅ ｎ ｉｃｉｔｙＸ ＩＡ Ｎ ＧＹ ａ ｈ － ｆ ａ ｎ ｇ ， Ｈ ＥＷ ｅ ｉ， Ｙ Ｕ Ａ ＮＪｉ—ｚｈ ａ ｏ ， Ｌ ＩＡ Ｎ ＧＺ Ｈ Ｉ—ｑ ｉｎ ｇ ， Ｓ Ｈ Ｉ Ｃ Ｈ Ａ Ｎ Ｇ － ｘ ｕ （ Ｄ ｅｐ ａ ｒｔｍ ｅｎ ｔ ｏｆＯ ｂｓｔｅｔｒｉｃｓａ ｎ ｄＧ ｙ ｎ ｅｃｏ ｌｏ —ｇ Ｙ ， Ｓ ｏ ｕ ｔｈ ｗ ｅ ｓｔ Ｈ ｏ ｓｐｉｔａ ｌ， 豫谢Ｍ ｉｌｉｔａ ｒｙＭ ｅｄ ｉｃａ ｌＵ ｎ 妇ｒｓｉｔｙ ， Ｃ ｈ ｏ ｎ ｇ ｑ ｉｎ ｇ４ ０ ０ ０ ３８ ， Ｃ ｈ ｉｎ ａ ）？［ Ａ ｂ ｓｔｒ ａ ａ ］Ｏ ｂ ｊｅｃｔｉｖ ｅＴ ｏｐ Ｉｌｒｉ母Ｆ Ｓ Ｈ － ｏ ｃｃｈ ｄ ｉｎ ｐ ｒ ｏ ｔｅｉｎａ ｎ ｄａ ｎ ａ ｌｙ ｚ ｅｉｔｓｉｍ ｍ ｕ ｎ ｏ ｇ ｅｎ ｉｃｉｔｙ ． Ｍ ｅｔｈ ｏ ｄ ｓＴ ｈ ｅｅ ｎ ｇ ｉｎ ｅ ｅ ｒ ｉｎ ｇ ｙ ｅ ａ ｓｔｓｔｒａ ｉｎＧ Ｓ ｌｌ５／ｐ Ｐ ＩＣ ９ Ｋｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓｓｉｎ ｇｔｈ ｅ Ｆ Ｓ Ｈ － ｏ ｃ ｃ ｌｕ ｄ ｉｎｐ ｒ ｏ ｔｅｉｎｗ ａ ｓ ｉｎ ｏ ｃｕ ｌａ ｔｅｄ ｉｎ ｔｏ Ｙ Ｐ Ｄ ｍ ｅ ｄ ｉｕ ｍａ ｎ ｄｓｕ ｂｃｕ ｌｔｕ ｒｅｄｃ ｏ ｎ ｔｉｎ ｕ ｏ ｕ ｓｌｙ ， ａ ｎ ｄｔｈ ｅ ｎ ｔｈ ｅｇ ｅｎ ｅ－ ｏ ｆ － ｉｎ ｔｅｒ －ｅ ａ ｔ Ｗ ａ ￥ ｄ ｅ ｔｅ ｃ ｔｅ ｄｂ ｙＰ Ｃ Ｒ ． Ａ ｆ ｔｅ ｒｔｈ ｅｅｎ 百鹏商吨ｙ ｅａ ｓｔｓｔｒａ ｉｎｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓｓｉｏ ｎｉｎ Ｂ Ｍ Ｍ Ｙｍ ｅｄ ｉｌｌｎ ｌ ｕ ｎ ｄ ｅ ｒｔｈ ｅｉｎ ｄ ｕ ｃ ｔｉｏ ｎ０ｆｍ ｅ ｔｈ ａ ｎ ｏ ｌ， ｔｈ ｅｓｕ ｐ ｅ ｍ ａ ｔａ ｎ ｔ０ｆｔｈ ｅｃｕ ｌｔｕ ｒ ｅＷ ａ Ｓｃｏ ｎ ｄ 朗１ｓｅｄ ａ ｎ ｄｌｏ ａ ｄ ｅ ｄｉＩｌｔｏ ｔｈ ｅｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｔｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｉｃｃ ｏ ｌｕ ｍ ｎｆ ｏ ｒｇ ｅ ｌｆ ｉｈ ｒａ ｔｉｏ ｎｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｔｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙ ． Ｂ ａ ｌｂ ／ｃｍ ｉｃ ｅ ｗ ｅ ｒ ｅｉＩ咖∞ｕ ｎ ｉｚｅｄｗ ｉｔｈｔｈ ｅｐ ｕ ｒｉｆ ｉｅｄ ｐ ｒ ｏ ｔｅｉｎａ ｎ ｄｔｈ ｅ ｓｅ ｒ ｕ ｍｍ 证ｂ（ 嘶ｌｅｖｅｌｗ ａ ｓｍ ｅ ａ ｓｕ ｒ ｅ ｄ ． Ｓ ｉｍ ｕ ｌｔａ ｎ ｅ ｏ ｕ ｓｌｙ ， ｔｈ ｅｅｘ ｐ ｒ ｅｓｓｉｏ ｎａ ｎ ｄｄ ｉｓｔｒｉｂ ｕ ｔｉｏ ｎ ｏ ｆｏｃｃｈｄｉｎ慨ｄｅｔｅｃｔｅｄｂ ｙｉｍ ｌｍ ｌ—ｎ ｏ ｈ ｉｓｔｏ ｃ ｈ ｅ ｍ ｉｓｔｒ ｙ ． Ｒ ｅ ｓｕ ｌｔｓ Ｔ ｈｅ唧璀劬１９ｙ ｅ ａ ｓｔｓｔｒａ ｉｎ ｄ ｉｄｎ ｏ ｔ ｌｏ ｓｅ ｔｈ ｅｅ ｘ ｏ ｇ ｅ ｎ ｏ ｕ ｓ ｇ ｅ ｎ ｅａ ｆ ｔｅｒｔｈ ｅ ｓｕ ｂｃｕ ｌｔｕ ｒｅ． Ｗ ｅｓｔｅｒｎｂｌｏ ｔａ ｎ ａ ｌｙ ｓｉｓｓｈ ｏ ｗ ｅ ｄｔｈ ａ ｔｔｈ ｅｐ ｕ ｒｉｆ ｉｅｄ ｐ ｒ ｏ ｔｅｉｎｈ ａ ｄｇ ｏ ｏ ｄｒ ｅ ａ ｃ ｔｏ ｇ ｅ ｎ ｉｃ ｉｔｙ ． Ｏ ｃ ｃ ｈ ｄ ｉｎＷ ａ Ｓｄ ｐ删ａｔａｖ ｅｒ ｙ ｈ ｉ曲ｌｅｖｅｌｉｎ ｔｈ ｅ ｔｒｉａ ｌｇ ｒ ｏ ｕ ｐ ． Ｔ ｈ ｅ ｐ ｕ ｒ ｉｆ ｉｅ ｄ 弘ｏ ｔｅ ｉｎｃ ｏ ｕ ｌｄｉＩｌｄ ｕ ∞ｔｈ ｅｓｐ ｅ ｃ ｉｆ ｉｃ 硼畦ｂ ｏ ｄ ｉ龆ｉｎｍ ｉｃｅ． Ｃ 叩ｃｈ萄伽Ｔ ｈｅ伽Ｉｇｉ啦咄ｙｅａｓｔｓｔｒａｉｎ麟弘蜘ｔｈｅＰ Ｓ Ｈ － ｏ ｃ ｃ ｌｕ ｄ ｉｎｐ ｒ ｏ ｔｅｉｎｈ ａ ｓｇ ｏ ｏ ｄｇ ｅ ｎ ｅ ｆ ｃ ｓｔａ ｂｉｌｉｔｙａ ｎ ｄｉｔｓｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓｓｉｏ ｎｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃｔｓｃａ ｌｌ ｅｌｉｃｉｔｔｈ ｅｓｐ ｅｃｉｆ ｉｃｈ ｕ ｍ ｏ ｒ ａ ｌ ｉｉｒａ ｎ ｕ ｎ ｅｒ ｅ ｓｐ ｏ ｎ ｓｅｉｎ ｍ ｉｃｅ．［ Ｋ ｅｙｗ ｏ 盯呶］Ｆ Ｓ Ｈ － ｏ ｅｅｌｕ ｄ ｉｎ ； Ｐ ｉｃｈ ｉａｐ ａ ａ ｔｏ ｒ ｉｓ； Ｐ ｕ ｒ ｉｆ ｉｃａ ｔｉｏ ｎ ； Ｉｎ ｍ ｍ ｎ ｏ ｇ ｅ ｎ ｉｃｉｔｙ研究表明： 由一系列协调的信号通路和分子调控了Ｓ ｅｒ ｔｏ ｌｉ细胞（ 睾丸支持细胞）间Ｔ Ｊｓ（ 紧密连接）的时相性“关闭” 和“开放” 从而促进生殖细胞顺利穿越上皮［ １’ ２］。 如果能干扰Ｓ ｅｒｔｏ ｌｉ细胞间的连接， 势必使正常的精子排放受到影响。 组成Ｔ Ｊｓ的膜蛋白包括闭锁因子（ ｔ）ｃｃｌｕ ｄ ｉｍ ）、 ｃｈ ｕ ｄ ｉｎ ｓ、 Ｚ Ｏ ． １和连接黏附分子（ ＪＡ Ｍ ）等， 其中闭锁因子（ ｏ ｅｃｌｕ ｄ ｉｎ ｓ）是组成Ｔ Ｊｓ的关键膜蛋白， 发挥Ｔ Ｊｓ的屏障和防护功能【３】 。 本研究选择仅有受体结合活性， 但无激素生物活性的【收稿日期］２０ ０ ７ —０ ７ 一１０ ； ［ 修回日期】 ２０ ０ ７ —０ ９ —２５［ 基金项目］国家自然科学基金资助项目（ ３０ ３０ ０ ３７ ５）［ 作者简介］向延芳（ １９ ７ ３一）， 女， 湖南衡阳市人， 医师， 博士， 主要从事生殖避孕方面的研究。 （ ’ Ｉ＇ｅ１）０ ２３－ ６８ ７ ５４ ４ １０ ； （ Ｅ － ｍ ａ ｉｌ）ｘ ｙ ｉ５２５７ ＠ １６ ３． ｃｏ ｒ ｎ＊ 通讯作者Ｆ Ｓ Ｈ ． 口亚单位中的部分序列， 与编码闭锁因子中发挥Ｔ Ｊｓ功能第二个胞外环的多肽相应基因序列进行基因重组¨ Ｊ， 并在构建表达Ｆ Ｓ Ｈ ． ｏ ｃｃｌｕ ｄ ｉｎ 融合蛋白酵母工程菌Ｇ Ｓ ｌ１５／ｐ Ｐ ＩＣ ９ Ｋ 的基础上， 利用分子筛层析的方法纯化了酵母工程菌的表达产物， 并进行了纯化蛋白的免疫原性研究。 由于男性Ｆ Ｓ Ｈ 受体仅存在于Ｓ ｅｒ ｔｏ ｌｉ细胞胞膜上， 那么融合蛋白将具有靶向作用Ｓ ｅｒｗ ｌｉ细胞Ｔ ＪＳ 的特性， 可能达到避孕的目的。１材料与方法１． １菌株表达Ｆ Ｓ Ｈ ． ｏ ｃｃｌｕ ｄ ｉｎ 蛋白的酵母工程菌Ｇ Ｓ ｌ１５／ｐ Ｐ ＩＣ ９ Ｋ 由作者构建（ 另文发表）， Ｆ Ｓ Ｈ 一（ 亚单位的第３３． １０ ０ 舱（ ６８ 个砚）分别与小鼠Ｏ ｃｃｌｕ ｄ ｉｎ 第二个胞外环２０ ７ ． ２２８ ａ ａ （ ２２个∞）及１９ ７ —２４ １ａ ａ （ ４ ５个龃）耦合， 分别命名为ｐ Ｐ ＩＣ ９ Ｋ － ６８ ４ ５与ｐ Ｐ ＩＣ ９ Ｋ － ６８ ２２。１． ２工具酶与生化试剂工具酶、 限制性内切酶为 万方数据
