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    188宝金博页面版: 福林酚试剂法测定蛋白质(1)

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    内容提示： 食品与药品 Food and Drug 2011年第 13卷第03期 147· 知识介绍·福林酚试剂法测定蛋白质Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A L, Randall R J自1922年Wu（吴） 提出用福林酚（Folin-酚） 试剂测[1]， 已有许多采用这一试剂的改良分析操作进行血清[2-6]、 抗原-抗体沉淀物[7-9]和胰岛素[10]中蛋白质含量定蛋白质含量 测定的报道。虽然这一试剂以其灵敏度高和操作简便得到推荐， 但并不适合普遍的生物化学应用。尽管这一试剂对某些应用有相当的优势， 但在全面开发之前需掌握它的特性和局限性， 已研究了 pH、 反应时间及反应物浓度、 处理蛋...

    文档格式：PDF | 页数：5 | 浏览次数：44 | 上传日期：2012-09-25 23:10:10 | 文档星级：
    食品与药品 Food and Drug 2011年第 13卷第03期 147· 知识介绍·福林酚试剂法测定蛋白质Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A L, Randall R J自1922年Wu（吴） 提出用福林酚（Folin-酚） 试剂测[1]， 已有许多采用这一试剂的改良分析操作进行血清[2-6]、 抗原-抗体沉淀物[7-9]和胰岛素[10]中蛋白质含量定蛋白质含量 测定的报道。虽然这一试剂以其灵敏度高和操作简便得到推荐， 但并不适合普遍的生物化学应用。尽管这一试剂对某些应用有相当的优势， 但在全面开发之前需掌握它的特性和局限性， 已研究了 pH、 反应时间及反应物浓度、 处理蛋白质常用试剂的允许水平和干扰物质等变化的影响。 本文说明了溶液中或采用酸及其他试剂沉淀后蛋白质， 以及低达0.2 μg的微量蛋白质的测定操作。1 方法1.1 试剂试剂A， 含2 % Na2CO3的0.10 mol/L NaOH。 试剂B，含0.5 % CuSO4•5H2O的 1 %酒石酸钠或酒石酸钾。 试剂C，碱性Cu溶液。 试剂A与试剂B以体积比50∶ 1混合， 1 d内使用。 试剂D， 碳酸铜溶液， 与试剂C相同， 但不含NaOH。试剂E， 稀释的Folin试剂。 以酚酞指示终点， 用NaOH滴定Folin-酚试剂[11]（Eimer and Amend, Fisher Scientific公司，纽约） 。 以此滴定为基础稀释Folin试剂（约2倍） 至酸为1 mol/L（1 N） 。 人血清稀释100～1000倍（约70～700 μg/mL）用作工作标准物质。 此可用结晶牛血清白蛋白标准溶液依次校正(Armour公司， 芝加哥)； 1 μg牛血清白蛋白相当于0.97 μg人血清蛋白（见下文） 。 实验发现稀释的牛血清白蛋白溶液由于显著的表面变性不适合作为标准。1.2 溶液中或稀碱中快速溶解蛋白质的操作 (定位于终体积1.1～1.3 mL, 当体积为此值的倍数或分数时可按所述操作1)（注释1见正文最后）含5～100 μg蛋白质的0.2 mL或更少体积的样品， 置于3～10 mL试管中， 加入试剂C 1 mL， 混匀后室温放置10 min以上。 迅速加入试剂E 0.10 mL， 并在1～2 s内混匀（见下文） 。 30 min或更长时间后， 用比色计或分光光度计测定样品。 终体积中蛋白质含量为5～25 μg/mL时， 在波长750 nm左右吸收峰处测定。 含量更高的溶液， 通过波长500 nm左右的测定使读数保持在可行范围内(见图2)。 根据标准曲线计算， 如果需要， 对现行标准和所测特定蛋白质间的色差值进行校正（见下文） 。加入碱性Cu试剂之前， 不需要所有样品的体积与标准溶液的相同。 所给出的校正就是针对终体积的微小差异。关键是碱性Cu溶液和Folin试剂的体积。 若蛋白质已存在于非常稀的溶液中（低于25 μg /mL） ，0.5 mL蛋白质溶液与0.5 mL两倍浓度的试剂C混合， 其他操作如上所述。1.3 不溶性蛋白质等多数蛋白沉淀物， 如钨酸盐沉淀物在碱性Cu试剂中易溶。 然而蛋白质经三氯醋酸或高氯酸沉淀后， 在0.1 mol/L此碱性试剂中极少溶解。 若继续采用脂溶剂提。 蛋白质变得更难溶解， 且100 ℃干燥后， 溶解难度更大。 下述操作不可能适用于所有情况， 但有助于酸沉淀蛋白质的测定。 若蛋白质量不多， 散布的相当。 在1 mol/L NaOH中于室温下通常0.5 h左右即可溶解。 因此， 5～100 μg沉淀蛋白质可加入1 mol/L NaOH 0.1 mL。 放置0.5 h或以上，加入试剂D（不含NaOH） 1 mL， 10 min后常规加入0.1 mL稀释的Folin试剂E。大样本或较难处理的沉淀物， 需要在1 mol/L碱溶液中100 ℃加热10 min以上。 虽然这样会造成结果低估， 但可重复性强， 且可用经相同处理的标准溶液进行测定2（注释2见正文最后） 。1.4 微量分析用适合0.05 mL体积的贝克曼分光光度计[12]， 可测定低达0.2 μg的蛋白质， 且精密度良好。 除减少样品和试剂的体积外， 唯一可行的改变是采用足够细长的试管进行反应。若试管的直径过大， 易造成结果低估。 下面是操作的说明， 需按序沉淀蛋白质， 如， 测定相同样品的酸可溶性构成。 在这一实例中， 假定样品体积忽略不计。 另外需采用更小体积较高浓度的三氯醋酸。含0.2～3 μg蛋白质的样品置于内径3 mm， 长4 cm的试管中3（注释3见正文最后） ， 加入5 %三氯醋酸10 μL4（注释4见正文最后） ， 混匀离心后， 弃去8 μL上清。 沉淀加8 mol/L NaOH 5 μL。 样品通过轻敲或震荡5（注释5见正文最后） 充分混匀， 并用橡皮帽或高分子膜封口。 30 min后加入试剂D 50 μL， 震荡器混匀， 放置10 min以上， 加入稀释的Folin试剂E 5 μL并迅速震荡混匀， 30 min 后测定。 标准溶液的制备可采用10 %三氯醋酸 5 μL分别沉淀5 μL 5 %，10 %， 20 %等血清蛋白溶液， 后续处理与其他样品相同。2 实验

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