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    188宝金博页面版: 海洋生物抗菌肽在枯草杆菌BS168中的高效表达_谢海伟

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    内容提示： Marine Sciences / Vol. 35, No. 3 / 2011 55 海洋生物抗菌肽在枯草杆菌 BS168 中的高效表达 谢海伟, 文 冰, 王 娣, 钱时权, 杨贤松, 许 晖 (蚌埠学院 生物与食品工程系, 安徽 蚌埠 233030) 摘要: 为了实现基因工程高效制备 tachyplesin, Ⅰ 采用 tachyplesinⅠ基因串联表达的方法, 以穿梭表达载体 pSBPTQ 为表达载体, 通过 RT-PCR 扩增 tachyplesinⅠ基因(tac)和采用直接退火的方法合成tachyplesinⅠ串联基因(2tac), 构建重组表达载体 pSBPTQ-TAC 和 pSBPTQ-2TAC, 转化到枯草杆菌BS168 实现高效表达。 实验结果表明: 基因 tac 和 2tac 在枯草杆菌...

    文档格式：PDF | 页数：9 | 浏览次数：48 | 上传日期：2015-06-06 21:38:52 | 文档星级：
    Marine Sciences / Vol. 35, No. 3 / 2011 55 海洋生物抗菌肽在枯草杆菌 BS168 中的高效表达 谢海伟, 文 冰, 王 娣, 钱时权, 杨贤松, 许 晖 (蚌埠学院 生物与食品工程系, 安徽 蚌埠 233030) 摘要: 为了实现基因工程高效制备 tachyplesin, Ⅰ 采用 tachyplesinⅠ基因串联表达的方法, 以穿梭表达载体 pSBPTQ 为表达载体, 通过 RT-PCR 扩增 tachyplesinⅠ基因(tac)和采用直接退火的方法合成tachyplesinⅠ串联基因(2tac), 构建重组表达载体 pSBPTQ-TAC 和 pSBPTQ-2TAC, 转化到枯草杆菌BS168 实现高效表达。 实验结果表明: 基因 tac 和 2tac 在枯草杆菌中表达成功, TAC 和 2TAC 抗菌肽表达量分别约为 8.5％、15.8％, 经高效液相色谱分析表达产物在发酵上清液中的含量约为 5.46、10.36 mg/L; 表达产物 TAC 和 2TAC 对大肠杆菌 K88 和金黄色葡萄球菌都具有明显的抑菌作用, 2TAC 经BrCN 水解产物抑菌活力高于 TAC, 而 2TAC 的表达产量大约是 TAC 的 1.89 倍。这表明通过tachyplesinⅠ串联表达产物降低了自身对宿主的毒性, 可以提高 tachyplesinⅠ的表达产量。 关键词: 抗菌肽 tachyplesin中图分类号: Q786 文献标识码: A 文章编号: 1000-3096(2011)03-0055-09 ; Ⅰ 表达载体构建; 串联表达; 抗菌活性 马蹄蟹(Horseshoe crab)是一类远古的海洋节肢动物。马蹄蟹血细胞中分离提取的一类抗菌肽[1], 具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖和 诱 导 癌 细 胞 分 化 的 生 物 活 性[2]。 抗 菌 肽tachyplesinⅠ因相对分子质量小不具备抗原性, 对原核生物细胞有很高的杀菌活性, 对真核生物的正常细胞则无明显毒副作用。抗菌时一般没有特殊受体, 不会诱导抗药菌株的产生, 是一类具有巨大潜在应用价值的抗菌肽。但由于马蹄蟹是一种珍贵的海洋生物, 物种稀少, 是濒临灭绝生物, 且 tachyplesinⅠ的分离纯化过程繁琐且费用较高; 通过化学合成制备, 价格昂贵, 生物活性低; 因此采用基因工程制备tachyplesinⅠ成为一种可行的方案[3]。 目前, 利用基因重组技术在体外大量制备活性多肽是生物制品研究的热点之一。对于分子质量较小的多肽, 如果用常规方法构建单拷贝基因的重组质粒, 则目的基因在细胞中的表达量很低, 无法体现基因工程产量高的优势。 因此, 本文建立了一种构建串联基因的方法, 以实现小分子多肽在体外的高效表达, 为小肽的串联表达提供了理论和实践依据。本研究为了克服基因工程制备 tachyplesinⅠ的缺陷, 设计构建 tachyplesinⅠ基因串联表达载体, 并将重组基因成功转化到分泌型表达系统枯草杆菌 BS168中, 实现了抗菌肽 tachyplesinⅠ的高效分泌表达。 1 材料与方法材料与方法 1.1 材材 料料 1.1.1 菌株和质粒菌株和质粒 克隆宿主菌 Escherichia coli. DH5α、大肠杆菌E.coli K88、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus) 为本室保存; 枯草杆菌 Bacillus subtilis BS168 为表达宿主菌, 由上海生命科学院植物生理与生态研究所惠赠; TA 克隆载体 pUCM-T 购自上海生工公司; 大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒 pSBPTQ[4]由中山大学罗进贤教授惠赠。 1.1.2 培养基和主要试剂培养基和主要试剂 马蹄蟹购自广东省深圳市水产品市场; 枯草杆菌感受态制备用 GMI、 GMII 培养基[5]; 发酵用 MSR培养基[6]。cDNA 合成试剂盒及各种工具酶均购自TaKaRa 公司; Trizol reagent 购自 Invitrogen 公司; 蛋 白 分 子 质 量 标 准 、 mRNA 纯 化 试 剂 盒 购 自 收稿日期: 2010-04-20; 修回日期: 2010-08-03 基金项目: 安徽省高校自然科学研究资助项目(KJ2009B014); 安徽省高等学校省级食品科学与工程特色专业建设点资助项目(20101091); 安徽省食品科学与工程教学团队项目资助(20101094); 蚌埠学院优秀人才基金项目及院级188宝金博页面版教学研究项目(JYLC1015); 高校省级优秀人才基金项目(2011SQRL166) 作者简介: 谢海伟(1978-), 男, 吉林桦甸人, 讲师, 博士, 主要从事多肽和酶工程方面研究, E-mail: xiehaiwei324@163.com

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