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    188宝金博页面版: 差异显示方法的条件优化

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    内容提示： 3国家自然科学基金 (No. 39600192) 资助课题　　　　 3 3 联系人Received 1998 2 11 2 19 　　 Accepted 1999 2 01 2 25银染 mRNA 差异显示方法的条件优化 3梁德勇　王晓民 3 3 　崔振中　徐国恒　朱丽霞 1 　韩济生( 北京医科大学神经科学研究所　北京　 100083;1中国中医研究院针灸研究所　北京　 100700)摘要　 mRNA 差异显示技术是分离差异表达基因的强有力工具。本工作旨在优化无同位素的银染差异显示方法。以总 RNA 为模板 , 用锚定引物与随机引物的组合进行 RT 2 PCR 反应 , PCR 扩增产物在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。用银染方法显示电泳 cD...

    文档格式：PDF | 页数：5 | 浏览次数：29 | 上传日期：2017-03-20 22:01:06 | 文档星级：
    3国家自然科学基金 (No. 39600192) 资助课题　　　　 3 3 联系人Received 1998 2 11 2 19 　　 Accepted 1999 2 01 2 25银染 mRNA 差异显示方法的条件优化 3梁德勇　王晓民 3 3 　崔振中　徐国恒　朱丽霞 1 　韩济生( 北京医科大学神经科学研究所　北京　 100083;1中国中医研究院针灸研究所　北京　 100700)摘要　 mRNA 差异显示技术是分离差异表达基因的强有力工具。本工作旨在优化无同位素的银染差异显示方法。以总 RNA 为模板 , 用锚定引物与随机引物的组合进行 RT 2 PCR 反应 , PCR 扩增产物在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。用银染方法显示电泳 cDAN 条带 , 其结果是: (1)RNA 加入量为 1 ～ 3 Λ g,RT 2 PCR 反应能扩增出较多的 cDNA 条带 , 而低于 0 1 5 Λ g 时扩增条带数目较少; (2)在 36 ～ 42 ℃的范围内 , 随着温度的增加 , 扩增的条带减少 ; 而 42 ℃时扩增的条带数目锐减 , 特别是当 RNA 加入量小于 1 Λ g 时几乎无条带显示 ; 36 ℃扩增的条带过多而趋于 smear; (3) 优化了银染液程序 , 染色液和显色液中 37% 甲醛的量分别为 0 1 03% ～0 1 05% 和 0 1 075% ～ 0 1 1% , 显色温度 4 ～ 12 ℃时 , 显示出清晰的条带; (4)用此方法获得数条电针镇痛有效与无效大鼠表达差异的 cDNA 条带。总之 , 通过改变参数条件 , 优化了快速简便的银染 mRNA 差异显示方法。关键词　 mRNA 差异显示　逆转录2聚合酶链反应　银染　基因表达OPTIM IZATION OF mRNA D IFFERENTIAL D ISPLAYW ITH SILVER STA ININGL IAN G De 2 Yong,WAN G Xiao 2 M in, CU I Zhen 2 Zhong, XU Guo 2 Heng, ZHU L i 2 Xia1 , HANJi 2 Sheng( N euroscience R esearch Institute , B eijing M ed ical U niversity , B eijing 100083;1 T he Institute of A cupunctureand M ox ibustion , China A cademy of T rad itional ChineseM ed icine , B eijing 100700)ABSTRACT 　 mRNA differential display is a powerful instrument to identify differentially expressedgenes. Thiswork is designed to optim ize a non 2 radioactive differential displayw ith silver staining. TotalRNAas template was reverse transcribed into corresponding cDNA s by 3 ′ anchor primer and the cDNA s wereamplified by polymerase chain reaction ( PCR ) w ith a set of one same 3 ′ anchor primer and one 5 ′ arbitrarilyprimer. The PCR products were then resolved on denaturing polyacylam im ide gel. cDNA bands werevisualized by silver staining. The results revealed as follow s: (1) The amount of RNA used was 1 ～ 3 Λg,which produced many cDNA bands by RT 2 PCR. Few of bandswere observed when the amount of RNA wasreduced to less than 0. 5 Λg. (2)cDNA bandswere decreased w ith increasing temperature in a range of 36 ～42 ℃. (3)Silver staining procedurewasmodified. The concentration of 37% formaldehyde in staining solutionand developing solution was optim ized, and the developing temperature was appropriate at 4 ～ 12 ℃ . (4)Several cDNA fragments were identified from brain of responder and non 2 responder rat for electroacupu 2ncture 2 induced analgesia. In conclusion, the silver staining mRNA differential display optim ized in parametersis a rapid and easy procedure.1 5 1Chin J Neurosci, 1999;Vol 15(2): 151 ～ 155 151技术方法

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