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    188宝金博页面版: 利用偶氮酪蛋白测定内切蛋白酶酶活

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    内容提示： 北京百奥康生物技术有限公司 利用偶氮酪蛋白测定内切蛋白酶酶活 操作说明书 Sigma Chemical Co., Azo-CaseinLot. 74H7165 。 溶解: 将粉末状的底物(2 g)放入120 ml烧杯中加入4 ml乙醇或工业甲基化酒精(IMS)用磁力搅拌器充分混合打碎所有的块状底物然后加入96 ml磷酸钠缓冲液(100 mM, pH 7.0;Buffer A)再次充分搅拌直到底物全部溶解大约10分钟可用玻璃棒驱散任何粘住烧杯边缘的偶氮酪蛋白溶解完全的溶液保存于可密封的容器中加入2滴甲苯以防止微生物的污染4°C下保存可以保存数周。 应用: 偶氮酪蛋白可以用于测定所有内...

    文档格式：PDF | 页数：4 | 浏览次数：768 | 上传日期：2012-11-25 09:27:58 | 文档星级：
    北京百奥康生物技术有限公司 利用偶氮酪蛋白测定内切蛋白酶酶活 操作说明书 Sigma Chemical Co., Azo-CaseinLot. 74H7165 。 溶解: 将粉末状的底物(2 g)放入120 ml烧杯中加入4 ml乙醇或工业甲基化酒精(IMS)用磁力搅拌器充分混合打碎所有的块状底物然后加入96 ml磷酸钠缓冲液(100 mM, pH 7.0;Buffer A)再次充分搅拌直到底物全部溶解大约10分钟可用玻璃棒驱散任何粘住烧杯边缘的偶氮酪蛋白溶解完全的溶液保存于可密封的容器中加入2滴甲苯以防止微生物的污染4°C下保存可以保存数周。 应用: 偶氮酪蛋白可以用于测定所有内切-蛋白酶对于酪蛋白的酶活 如细菌碱性蛋白酶(e.g. Subtillisin A, as in Alcalase from Novo Nordisk)、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、真菌性和细菌性蛋白酶以及菠萝蛋白酶。此说明书中提供了枯草杆菌蛋白酶A、胰蛋白酶和糜蛋白酶的标准曲线对于其他的蛋白酶提供有计算用的回归方程式偶氮酪蛋白测定蛋白酶酶活的灵敏度低于蛋白酶AK测试药片的灵敏度大约20-50%。 标准曲线适合于在pH 7.0下制作对于在更广泛的pH和温度等条件下使用内切蛋白酶制作标准曲线并不是每一种情况下都能产生标准曲线对于特定需求您可以直接联系我们。 提取、稀释和试验用的缓冲液: BUFFER A: (磷酸钠, 100 mM, pH 7) 用900 mL蒸馏水溶解17.8 g二水磷酸氢二钠(Na2HPO4•2H2O)并用1 M氢氧化钠(40 g/L)调节pH到7.0然后将体积调整到1L4°C下保存可加入叠氮化钠(0.2 g; Sigma S-2002)作为防腐剂使用。 BUFFER B: (磷酸钠, 100 mM, pH 7),半胱氨酸(30 mM)和EDTA (30 mM) 用450 mL蒸馏水溶解8.9 g二水磷酸氢二钠(Na2HPO4•2H2O)、一水L-盐酸半胱氨酸(2.65 g; Sigma C-7880)和乙二胺四乙酸(5.6 g, EDTA; Sigma ED2SS)并用1 M氢氧化钠(40 g/L)调节pH到7.0然后将体积调整到500 m L4°C下保存2天内使用完。 注意 对于硫羟基蛋白酶如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶需要使用Buffer B进行提取和稀释对于其他蛋白酶可以使用Buffer A 酶的提取和稀释: 1.0 g粉末状酶制剂加入50 mL的Buffer A或B在室温中用磁力搅拌器充分搅拌15分钟直到粉末全部溶解或驱散如有必要可以过滤或离心(1,000g)此溶液即为最初提取液还需要进一步对提取液进行稀释(1 mL+9 mL of Buffer A or B)直到适合于试验要求的浓度。 1.0 mL液体酶制剂加入49 mL的Buffer A或B并充分搅拌混匀如有必要可以过滤或离心(1,000g)此溶液即为最初提取液还需要进一步对提取液进行稀释(1 mL+9 mL of Buffer A or B)直到适合于试验要求的浓度。Alcalase蛋白酶大约需要100倍稀释 实验步骤: 1. 2. 3. 4. 10分钟 5. 北京市通州工业园云景东里 361-622 邮编:101101 电话/传真:010-81517573 E-mail:lu_chuncheng@hotmail.com 底物: 用对氨基苯磺酸染色酪蛋白制备成为偶氮酪蛋白染色过程是经严格控制的其灵敏度是其它产品的5倍如1.0 ml 已经处理好的酶溶液[用Buffer A或B(pH 7.0)]加入1.0 ml已经用Buffer A处理好的底物 用漩涡混合器充分混合并在40°C下孵育10分钟 加入5%的三氯醋酸(TCA, 6.0 ml)用漩涡混合器充分混合5秒钟未水解的偶氮酪蛋白被沉淀反应结 将反应管置于室温下平衡5分钟然后用Whatman No.1 (9 cm)滤纸过滤或者在3,000 rpm (1,000g)下离心相对于空白对照在440 nm 下测定反应管的吸光度值

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