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· 《上海畜牧兽医通讯 》 ２０１５ 年第 ２期 · ２２ Ｔ ＡＬＥＮ 和 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ 两个基因编辑新技术 ＊ 汪加兴 张淑君 （华中农业大学动物科技学院农业动物遗传育种与繁殖188宝金博页面版部重点实验室 湖北 武汉 ４３００７０ ） 【摘要 】 Ｃ ＲＩＳＰ Ｒ （ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏ ｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ ）／ Ｃａｓ （Ｃ ＲＩＳＰ Ｒ －ａｓ－ ｓｏｃｉａｔｅｄ ）、Ｔ ＡＬＥ Ｎｓ （Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）作 为 分 子 生 物 学 工 具 ，在基 因编辑和改造 、药物打靶等方面具有非常重要的应用和发展前景 。 本文就 ＣＲＩＳＰＲ ／ Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ 的技术进行介绍 。 关键词 ：ＴＡＬＥＮ；ＣＲＩＳＰＲ ／ Ｃａｓ；基因敲除 ；转基因技术 DOI:10.14170/j.cnki.cn31-1278/s.2015.02.008 ２１ 世纪随着 ＤＮＡ 序列精细图谱的成功完成 ， 产生 。 宣告了生命科学领域正式进入后基因组时代 ，对所 １ 基因编辑的新技术的发现 有未知功能 的 基 因 进 行 功 能 性 分 析 成 为 当 前 最 重 Ｔ Ａ Ｌ Ｅｓ （Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ） 要的任务 〔１〕 。 在这一 过 程中模式 生物的应用 ，尤 其 基因编辑技 术 作 为 第 二 代 新 型 基 因 编 辑 分 子 生 物 是基因敲除 小 鼠 模 型 的 建 立 对 于 解 读 这 部 天 书 有 学工具 ，首次发现于细菌 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＡｖｒＢｓ３ 蛋 着巨大的 帮 助 。 基 因 敲 除 小 鼠 模 型 从 动 物 整 体 水 白的 研 究 中 。 科 学 家 发 现 来 自 植 物 细 菌 Ｘａｎ － 平对基因的功能进行研究 ，该模型具有很多其他技 ｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ ．的 ＴＡＬ蛋白核酸结合域的 氨 基 酸 序 术手段不具备且无法比拟的优点 〔２〕 。 然而针对基因 列与其靶位点上的核酸序列具有特定的配对关系 。 敲除小 鼠 模 型 建 立 时 所 存 在 的 缺 陷 与 不 足：周 期 科学家们利用发现于 Ｘａｎｔｈｏｍ ｏｎａｓ Ｔ Ａ Ｌ 的序列模 长 、风险性大 、技术含量高 ，至今为止国内外在基因 块 ，构建出针 对 任 意 核 酸 靶 序 列 的 重 组核酸酶，在 编辑及药物打靶等方面仍没有取得突破性的进展 ， 特异位点剪 切 靶 基 因，敲 除 该 基 因 功 能，从而达到 从而导致该 技 术 不 能 够 充 分 满 足 商 业化、快速化、 靶向特异性操作内源性靶基因表达的目的 。 高通量化研究基因功能的要 求。因此 ，寻求一种可 Ｃ ＲＩＳ Ｐ Ｒ （ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ 以快速产生 基 因 敲 除 效 果 的 策 略 模 型 成 为 生 物 学 ｐａｌｉｎｄｒｏ ｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ ）／ Ｃａｓ （Ｃ ＲＩＳＰ Ｒ －ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ） 系 进一步发展的需要 。 统是在细菌 和 古 细 菌 中 发 现 的 一 种 获 得 性 免 疫 系 锌指 核 酸 （ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ， ＺＦ Ｎｓ ）技 术 在 统 ，通过特异性 ＲＮＡ 介导对外源入侵 ＤＮＡ 进行特 一定程度 上 满 足 了 快 速 产 生 基 因 敲 除 的 需求，但 异性切割降解 〔５〕 。 研究表明该系统存在 ３ 大类型 ：Ｉ 是这种技 术 对 基 因 没 有 高 效 的 敲除，同时对细 胞 型、Ⅱ型和 Ⅲ 型系统，每个系统 均 由 复 杂 的 结 构 与 会造 成 一 定 的 毒 性 。２００９ 年 Ｓｃｉｅｎｃｅ 上 发 表 了 ２ 相应的 Ｃａｓ 蛋白组成 ，我们所说的 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ 编 篇利用 ＴＡＬＥ 技术成功对特 定 基 因 进 行 敲 除 的 文 辑技术一般指的是 Ⅱ 型 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ 系 统 〔６〕 。 章 ，宣告了 ＴＡＬＥ 理论上可以对任 何 双 链 ＤＮＡ 进 ２ 基因编 辑 的 新 技 术 载 体 的 构 建 与 基 因 敲 行编辑 〔３～４〕 。 随后一年第 一 个 Ｔ ＡＬＥＮ 被 设 计 出 ， 除编辑 揭示了 ＴＡＬＥ理论在 基因编辑、药物 打 靶 中 的 潜 在用途 。 ２．１ ＴＡＬＥ 靶 点识 别 模 块 对 应 关 系 及 其构 建与基因敲除 ２０１２ 年 研 究 报 道 了 一 种 新 型 基 因 编 辑 技 术 ＣＲＩＳＰＲ ／ Ｃａｓ，该 系 统 虽 然 早 在１９８７年就已经被 发现 ，但是 当 时 并 没 有 发 现 其 在 基 因 编 辑 过 程 的 作用 ，随着第 一 个 ＣＲＩＳＰＲ ／ Ｃａｓ 基 因 编 辑 实 验 的 成功 ，科学家们对 其 进 行 了 广 泛 而 深 入 的 研究，这 些研 究 成 果 标 志 了 第 三 代 基 因 编 辑 技 术 正 式 ＴＡＬ 核酸识别单位为重复的 ３４ 个恒定的氨基 酸序列 ，其中 １２、１３ 位点的双链氨基酸与 Ａ 、Ｃ、Ｔ 、Ｃ 有恒定的对应关系 ，即 ＮＧ 识 别 Ｔ，ＮＩ识 别 Ａ ，ＨＤ 〔３〕 。 为 获 得 识 别 某 一 特 定 核 酸 识别 Ｃ，ＮＮ 识 别 Ｇ 序列的 ＴＡＬＥ，只须按照 ＤＮＡ 序列将相应的 ＴＡＬ 单元串联克隆即可 。 鉴于物种基因组大小的不同 ， 选择的特异序列长度也不 同，对于哺 乳类动物包括 ＊ 为通讯作者 资助项目 ：国家自然科学基金 （３１２７２４２７ ）、欧 盟 ＦＰ７ 项目 （ＰＩＩＦ－Ｇ Ａ － 人类 ，一般选取 １６～２０ｂｐ 左右的 ＤＮＡ 序列作为识 ２０１２－３２８２０５ ，ＰＩＩＦＲ －ＧＡ－２０１２－９１２２０５ 和 ＦＰ７ －ＫＢＢＥ－２０１３－７－６１３６８９ ） 别靶点 。